三階段純化策略

純化問題所涉及的具體步驟zui終取決于樣品的性質(zhì)。但也有共同可參考的階段

捕獲階段：目標(biāo)是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白。

中度純化階段：目標(biāo)是除去大多數(shù)大量雜質(zhì)，如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。

精制階段：除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。

分離方法的選擇

根據(jù)蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)采用不同的分離方法：

每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡。

分辨率：由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來實現(xiàn)。總的來說，當(dāng)雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白性質(zhì)相似時，在純化的zui后階段分辨率是重要因素。

處理量：一般指在純化過程中目標(biāo)蛋白的上樣量。如上樣體積、濃度等。

速度：在初純化中是重要因素，此時雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快除去。

回收率：隨著純化的進行漸趨重要，因為純化產(chǎn)物的價值在增加。

在三階段純化策略中每一種方法的適用性見下表：

提示：

1、通過組和各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至zui少，以避免需要調(diào)節(jié)樣品。*個步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應(yīng)適宜于下一個步驟的起始條件。

2、硫酸銨沉淀是常用的樣品澄清和濃縮方法，所以HIC是捕獲階段的理想方法。

3、GF很適宜在由濃縮效應(yīng)的方法（IEX、HIC、AC）后使用，凝膠過濾對上樣體積有限制，但不受緩沖液條件的影響。

4、在捕獲階段選擇對目標(biāo)蛋白具有zui高選擇性或/和處理量的方法

5、如果對目標(biāo)蛋白的性質(zhì)了解甚少的情況下，可采用IEX-HIC-GF的方法組合作為標(biāo)準(zhǔn)方案。

6、只要目標(biāo)蛋白耐受的情況下，可以考慮采用RPC方法用于精制階段。

注：應(yīng)該指出，三階段純化策略不是說所有的策略都必須是三個純化步驟。所用的步驟數(shù)目取決于純度要求和蛋白的zui終用途。

附：純化工藝路線