擴增酶切片段多態性（Amplified Restriction fragment polymorphism，AFLP）是由Zabeau等（1992）發明，并于1993年獲得歐洲，該的權現在由荷蘭Keygene公司擁有；被譽為新一代的分子標記技術。
AFLP實質上是RFLP和RAPD的的結合和發展，它繼承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷。AFLP只需要極少量的DNA材料，不需要Sourthern雜交，不需要預先知道DNA的順序信息，實驗結果可以提供大量穩定可靠的信息。同時，AFLP產物是典型的孟德爾方式遺傳。
AFLP的基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增。首先用限制性酶產生基因組DNA酶切片段，然后使用雙鏈接頭與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴增反應的模板。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結合位點。引物由三部分組成：①核心堿基序列，該序列與人工接頭互補；②限制性內切酶識別序列；③引物3’端的選擇堿基。選擇堿基延伸到酶切片段區，這樣只有那些兩端序列能與選擇堿基配對的限制性酶切片段被擴增。擴增片段通過變性聚丙烯酰胺電泳分離檢測。被擴增的DNA限制性酶切片段由二個限制性內切酶產生，一個為酶切位點較少的限制性酶（如EcoR I），另一個為多酶切位點的限制酶（如Mse I）。所以，AFLP反應的結果是主要擴增那些由上述兩種酶共同酶切的片段。采用雙酶切的原由是：①多位點酶切產生小的DNA片段，這些片段易被擴增且片段長短適宜在變性膠上分離；②切點數少的酶可減少擴增片段的數目。由于擴增片段是由多切點酶和切點數較少的酶酶切后產生酶切片段，這樣就可選擇擴增時所需的選擇堿基數目限制在一定的范圍內；③利用雙酶切使對PCR產物的單鏈進行標記成為可能，從而防止膠上由于擴增片段雙鏈遷移率不一致而造成的雙帶現象（doublets）；④雙酶切可以對擴增片段的數目進行使活調節；⑤通過少數引物可產生許多不同的引物組合，從而產生大量的不同的AFLP指紋。AFLP技術包括三個主要內容：①模板的制備；②片段的擴增；③聚丙烯酰胺變性膠電泳分離檢測。
引物的設計對AFLP的成功與至關重要。引物的設計主要取決于人工接頭的設計，接頭為雙鏈的寡核苷酸，其設計遵循隨機引物的設計原則，應避免自身配對并具有合適的G、C含量。人工接頭未進行磷酸化處理，所以只有一條單鏈被連接在酶切片段末端。Vos等發現擴增結果較好的引物都具有5’端以G堿基開始的特點，以有效地防止雙鏈的形成，同時他們還發現引物3’端寡核苷酸的摻入受dNTP濃度的影響，無論5’端使何種堿基，dNTP濃度過低時雙鏈結構容易產生。對于雙酶切反應來說，引物的組合數共有（2n）2種（n為選擇堿基的數目）。引物選擇堿基的數目一般不超過三個，當引物具有一個或二個選擇堿基時，引物的特異選擇性較好，選擇堿基增加到三個時，引物的選擇特異性仍然不錯，但隨著引物選擇堿基的增加，引物與模板的錯配頻率相應增加，擴增的特異性發生下降。在利用AFLP技術分析較為復雜的基因組時，擴增反應分為兩個步驟，先用單選擇堿基引物進行擴增，然后再利用多個選擇堿基（如3個）的引物進行擴增，這樣既可以提高指紋圖譜的清晰度，亦可減少非特異性擴增的發生。
2 試驗條件
【藥品試劑】
5×RL+-Buffer：
50mM Tris·Hac（pH 7.5）
50mM Mg (Ac)2
250mM KAc
25mM DTT
250ng/ml BSA
EcoR I（Pharmacia）
Mse I（N. E. biolabs）
Mse I接頭
EcoR I接頭
10mM atp
T4 dna連接酶