聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件在體外酶促合成特異DNA片段的循環(huán)反應(yīng)，可使目的DNA片段得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置于高溫(約93℃-95℃)下使之變性解鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫(約50℃-70℃)下分別與目的DNA片段兩側(cè)的互補序列復(fù)性結(jié)合；引物在DNA聚合酶作用（約70℃-75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互補鏈。如此經(jīng)過n個周期，理論上擴增2n倍,一般PCR經(jīng)30-40周期后可獲得百萬倍以上的目的DNA。
聚合酶鏈式反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)（PCR—RFLP）分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點上，使酶切位點增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應(yīng)用PCR—RFLP，可檢測某一致病基因已知的點突變，進行直接基因診斷，也可以此為遺傳標記進行連鎖分析進行間接基因診斷。
本實驗以家族性甲型血友病患者及其相關(guān)成員外周血DNA為模板，PCR擴增凝血因子FⅧ基因的583bp特異片段產(chǎn)物，其中包含MspⅠRFLP多態(tài)位點，經(jīng)MspⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測等位片段的長度（583bp或360bp+223bp），以此為遺傳標記進行連鎖分析，判斷胎兒是否得到了帶有缺陷FⅧ基因的染色體，從而做出間接基因診斷。

【實驗用品】
1．DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、Taqdna聚合酶（5U/μl）10×PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP（2.5mM）、滅菌蒸餾水、液體石蠟、限制性內(nèi)切酶MspⅠ（20U/μl）、10×酶切緩沖液。
2．2%的瓊脂糖凝膠、5×TAE、6×上樣緩沖液、DNA Marker、溴化乙啶貯存液（10mg/ml）（EB）。
3．PCR自動熱循環(huán)儀、紫外透射儀、微量加樣器（20μl、200μl）、槍頭（20μl、200μl）及離心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、燒杯、保鮮膜、封口膜、浮漂、微波爐、250ml三角燒瓶、透明膠帶、托盤天平、臺式高速離心機。

【實驗步驟】
一．PCR反應(yīng)
PCR反應(yīng)體系20μl，其成分如下：
PCR－RFLP分析技術(shù)
按以上次序，將各物質(zhì)加入到一只無菌的0.5ml離心管中。輕輕混勻后，離心5秒鐘，加入一滴液體石蠟蓋于反應(yīng)混合液的表面，然后放入PCR儀中進行循環(huán)反應(yīng)。

PCR 反應(yīng)循環(huán)溫度：
94℃預(yù)變性3分鐘，然后進行以下循環(huán)30次
PCR－RFLP分析技術(shù)
zui后經(jīng)72℃再充分延伸7分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后置4℃冰箱保存。

二．PCR產(chǎn)物的MspⅠ酶切
反應(yīng)體系20μl其成分如下：
PCR－RFLP分析技術(shù)
置37℃水浴消化1小時，4℃保存。

三． 瓊脂糖凝膠電泳檢測
1．膠板的準備
取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意，將透明膠帶緊貼于有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
2．2%的瓊脂糖凝膠的制備
稱取1克瓊脂糖，置于錐形瓶內(nèi)，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到2%瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶貯存液（10mg/ml），使溴化乙啶終濃度為0.5μg/ml。小心混勻并倒在有機玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開，避免產(chǎn)生氣泡，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1小時左右，待膠凝固*后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。
3．將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預(yù)電泳10min。
4．每份限制酶切產(chǎn)物取10μl，加2μl 6×上樣緩沖液，混勻后加入到樣品孔中，以100V 電泳50分鐘。
5．?dāng)嚯姾笕〕瞿z，放在紫外透射儀中觀察并記錄PCR—RFLP結(jié)果。

【實驗結(jié)果與分析】
根據(jù)甲型血友病患者及其相關(guān)成員的親屬關(guān)系繪制遺傳系譜圖，觀察并記錄瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段長度，繪制出家系各成員FⅧ基因MspⅠ RFLP等位片段與系譜相關(guān)圖，進行連鎖分析，判斷胎兒是否是甲型血友病患兒。