摘要：微囊泡（MVs）通過(guò)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的脂質(zhì)和蛋白成分到靶細(xì)胞作為細(xì)胞之間通訊的新機(jī)制出現(xiàn)，但其在疾病中的功能才剛剛開(kāi)始被研究。我們發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞來(lái)源的MVs在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中的濃度與血漿濃度相比有所升高。關(guān)節(jié)液MVs過(guò)表達(dá)消炎、抗炎蛋白膜聯(lián)蛋白A1（AnxA1）。TMEM16F是一種脂質(zhì)爬行酶，在微囊泡形成過(guò)程中發(fā)揮作用。而TMEM16F缺陷小鼠當(dāng)經(jīng)受炎性關(guān)節(jié)炎時(shí)軟骨損傷可加重。為了明確MVs在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用，探索以MVs為基礎(chǔ)的治療策略的可能性，我們?cè)趪X類(lèi)動(dòng)物模型和人類(lèi)原代軟骨細(xì)胞中檢測(cè)了免疫細(xì)胞來(lái)源的MVs的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，外源性中性粒細(xì)胞來(lái)源的AnxA1陽(yáng)性的MVs激活軟骨細(xì)胞合成代謝基因的表達(dá)，通過(guò)減少壓力適應(yīng)的自我調(diào)節(jié)因子IL-8和前摘要：微囊泡（MVs）通過(guò)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的脂質(zhì)和蛋白成分到靶細(xì)胞作為細(xì)胞之間通訊的新機(jī)制出現(xiàn)，但其在疾病中的功能才剛剛開(kāi)始被研究。在活體實(shí)驗(yàn)中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射AnxA1(+)MV可減少類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的軟骨退化。接受過(guò)繼轉(zhuǎn)移的中性粒細(xì)胞的關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨基質(zhì)中顯示出大量的MVs，表明是MVs而非中性粒細(xì)胞自身穿透軟骨。通過(guò)MVs相關(guān)的AnxA1與其受體FPR2/ALX互作模型的機(jī)制研究顯示兩者相互作用，從而使軟骨細(xì)胞TGF-β產(chǎn)生增加，zui終引起軟骨的保護(hù)。我們猜想，MVs可以作為一個(gè)*的治療策略，要么通過(guò)直接或者裝藥的形式用于保護(hù)與軟骨退化相關(guān)的疾病。

圖1：人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜液中含有豐富的ANXA1陽(yáng)性嗜中性粒細(xì)胞MV來(lái)保護(hù)軟骨。

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圖1 A、B在RA患者血液和關(guān)節(jié)滑液中MV（A圖）和ANXA1陽(yáng)性MV（B圖）CD66b（中性粒細(xì)胞來(lái)源）、CD14（單核細(xì)胞來(lái)源）、CD3（T細(xì)胞來(lái)源）的表達(dá)水平。

圖1 C、D用更多的例數(shù)驗(yàn)證CD66b（中性粒細(xì)胞來(lái)源）的MV比另外兩種更多。

圖1 F 比較野生型和TMEM16F缺陷小鼠的膝蓋、踝關(guān)節(jié)、足趾樣本，缺陷小鼠的關(guān)節(jié)損傷更為嚴(yán)重。

圖2：源自健康中性粒細(xì)胞的AnxA1-richMVs的生成與特征。

圖2A、B、C 分別用TNF-a (50 ng/ml) 和vehicle (Control)刺激嗜中性粒細(xì)胞；超過(guò)75％的MV是CD66b+和結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V，而大約60％的MV是陽(yáng)性鬼筆環(huán)肽；MV還表達(dá)髓系相關(guān)蛋白8（MRP8）以及其結(jié)合配體MRP14。

圖2D、E、F：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（D、E）和Westernblotting（F）檢測(cè)AnxA1的表達(dá)，TNF刺激過(guò)的MV陽(yáng)性率更高；然而經(jīng)TNF刺激過(guò)的每個(gè)MV總蛋白含量并無(wú)變化。

圖2 H：納米粒子追蹤分析（NTA）提供的測(cè)量合并的MV（TNF）樣品，其中90％的囊泡直徑<412毫微米，zui高頻率是143毫微米。

圖2 J：用TNF-a， interleukin-8 (IL-8)和佛波醇脂(PMA)處理后的MV量。K：獲得的MV在120分鐘達(dá)到，在稍后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察到中性粒細(xì)胞外陷(NET)。

圖3：中性粒細(xì)胞的MV引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚，而且是體外保護(hù)軟骨細(xì)胞的微團(tuán)。

圖3 A：用TNF處理的MV和對(duì)照組MV治療軟骨細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的積累上并無(wú)差別。B：我們測(cè)量了上清液中酶促裂解的sGAG，發(fā)現(xiàn)IL-1β治療后會(huì)引起更多的蛋白多糖釋放。

圖3 C：軟骨的IL-1β治療會(huì)引起ACAN 和COL2A1（兩種zui豐富的軟骨基質(zhì)蛋白）和SOX9（驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)減少；D：與MV共培養(yǎng)后也出現(xiàn)了不同分子量的條帶。

圖3 E：無(wú)論是MV Ctrl還是MV TNF都顯著降低了IL-8（約30％降低）和PGE2（> 80％抑制）的釋放；F：高水平的IL-1β（50毫微克/毫升）增加了C28/ I2軟骨細(xì)胞凋亡。

圖3 G：IL-1β治療后TGFB1表達(dá)下調(diào)約2倍，而與MVTNF細(xì)胞共培養(yǎng)后明顯上調(diào)了，不論有沒(méi)有經(jīng)過(guò)IL-1β治療。H：嗜中性粒細(xì)胞MVTNF中共培養(yǎng)時(shí)，阻斷TGF-β導(dǎo)致中性粒細(xì)胞合成代謝的顯著降低（？50％）。

圖4：MV在體內(nèi)和體外環(huán)境下進(jìn)入軟骨，傳遞AnxA1。

圖4 A：我們觀(guān)察到MV到達(dá)軟骨細(xì)胞的遷移，在兩種外植體中都能發(fā)現(xiàn)。B：然而相比之下，IL-1β刺激的外植體遷移的距離更遠(yuǎn)。C：與*是MV TNF相比，MVTNF與IL-1β共同作用減少了sGAG的缺失。

圖4 D：IL-1β處理的大鼠軟骨外植體與MV TNF共培養(yǎng)的標(biāo)本用AnxA1染色。

圖4 E：將軟骨外植體與MDM來(lái)源（CD14+）的MV共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)缺少軟骨的滲透，甚至只黏附在關(guān)節(jié)表面，而中性粒細(xì)胞來(lái)源（CD66b+）的MV可以滲透進(jìn)基質(zhì)中。

圖4 F：小鼠腕部的標(biāo)本，用MRP14和DAPI染色。

圖5：MV引起的軟骨保護(hù)需要AnxA1和其受體FRP2/ALX。

圖5  A、B：用ECM沉積標(biāo)準(zhǔn)化為DNA含量，比較野生型和Anxa1缺失型小鼠在IL-1β和MV TNF處理下的DNA含量。C：在C28/I2 微團(tuán)中FPR2/ALX表達(dá)。

圖5 D ：電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的FPR2/ALX和AnxA1在軟骨細(xì)胞中存在，并頻繁地共同結(jié)合。

圖5 E：IL-1b的降解效果在所有動(dòng)物的軟骨外植體都類(lèi)似。F：C28/I2微團(tuán)的上清液中全部的TGF-b1含量。

圖6：在炎癥性關(guān)節(jié)炎模型中中性粒MV保護(hù)軟骨的退化。

圖6 （A、B、C）：ANXA1和FPR2/ALX可以保護(hù)嗜中性粒細(xì)胞的MV的性能。作者通過(guò)建立炎癥模型去驗(yàn)證之前的結(jié)論。

好啦今天的文獻(xiàn)就解讀到這里，下面是問(wèn)答環(huán)節(jié)：

我們應(yīng)怎樣利用這些微泡為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者提供更好的治療方向？

首先這些微泡本身具有治療關(guān)節(jié)炎癥的效果，加強(qiáng)微泡的釋放可以加強(qiáng)治療；此外它是罕見(jiàn)的可以穿透軟骨的物質(zhì)，我們可以利用微泡包裹藥物穿透軟骨進(jìn)行治療，這篇文章的發(fā)現(xiàn)對(duì)后續(xù)治療的研發(fā)價(jià)值很大