1　概　述
　　核酸的分子雜交(molecular hybridization)技術(shù)是目前生物化學和分子生物學研究中應用zui廣泛的技術(shù)之一，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的堿基互補原則而發(fā)展起來的。在堿性環(huán)境中加熱或加入變性劑等條件下，雙鏈DNA之間的氫鍵被破壞(變性)，雙鏈解開成兩條單鏈。這時加入異源的DNA或RNA(單鏈)并在一定離子強度和溫度下保溫(復性)，若異源DNA或RNA之間的某些區(qū)域有互補的堿基序列，則在復性時可形成雜交的核酸分子。
　　在進行分子雜交技術(shù)時，要用一種預先分離純化的已知RNA或DNA序列片段去檢測未知的核酸樣品。作為檢測工具用的已知RNA或DNA序列片段稱為雜交探針(probe)。它常常用放射性同位素來標記。
　　雖然核酸分子雜交技術(shù)的應用僅有二十多年的歷史，但它在核酸的結(jié)構(gòu)和功能的研究中作出了重要貢獻，在基因的表達調(diào)控和物種的親緣關(guān)系研究中也發(fā)揮重要作用。而且，隨著核酸探針制備及標記技術(shù)的豐富和完善以及以不同材料為支持物的固相雜交技術(shù)的發(fā)展，使核酸分子雜交技術(shù)在分子生物學領(lǐng)域中的應用更加廣泛。這里我們將就分子雜交技術(shù)的幾個主要過程及其應用進行介紹。

2　核酸探針的制備
　　核酸分子雜交的靈敏性主要依賴雜交探針的放射性比活度。比活度高就可提高反應的靈敏性，減少待測樣品的用量。目前一般所用的是體外標記，這里介紹幾種zui常用的方法：
2.1　DNA的切口平移
　　雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時，大腸桿菌dna聚合酶Ⅰ可把核苷酸殘基加到切口處的3’端，同時由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它還可從5’端除去核苷酸。這樣5’端核苷酸的去除與3’端核苷酸的加入同時進行，導致切口沿著DNA鏈移動，稱切口平移(nicktranslation)。常用于在雙鏈DNA上打開切口的酶為胰DNA酶Ⅰ。由于高放射性比活度的核苷酸置換了原有核苷酸，就有可能制備比活度大于108計數(shù)/(分.μg)的32P標記的DNA探針。
2.2　單鏈DNA探針的制備
　　與傳統(tǒng)的雙鏈探針相比，單鏈探針由于不存在互補鏈，因此可以消除由探針的兩條鏈重退火形成無效雜交體的可能。zui常用的是以M13噬菌體載體合成單鏈DNA探針的方法。其主要原理是用人工合成的寡核苷酸引物(其序列與載體上固定區(qū)段的序列相互補。可從生物試劑公司直接購買)與來自重組M13噬菌體的單鏈DNA退火，然后以此寡核苷酸作為引物在大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段催化下合成互補的放射性標記DNA。
2.3　單鏈RNA探針的制備
　　首先將感興趣的DNA序列克隆到帶有SP6噬菌體或T7及T3噬菌體的啟動子的重組載體質(zhì)粒中。由于這些重組質(zhì)粒帶有的強啟動子能被噬菌體的依賴DNA的RNA聚合酶所識別。因此，當把線狀質(zhì)粒與適當?shù)囊蕾嘍NA的RNA聚合酶及4種rNTP(核糖核苷三磷酸)在體外混合并溫育時，就可在噬菌體啟動子處開始合成RNA。
　　單鏈RNA探針除具有單鏈DNA探針的優(yōu)點之外，還具有：①合成效果高(模板可反復被轉(zhuǎn)錄)；②用DNA酶Ⅰ處理就可容易除去RNA探針中的模板DNA，而無需用凝膠電泳純化；③RNA雜交體穩(wěn)定性高，所以探針在雜交反應中產(chǎn)生的信號較DNA探針強，等優(yōu)點。

3　雜交膜的準備
　　核酸的分子雜交可分成液相雜交和固相雜交兩大類。液相雜交是將待檢測的核酸樣品和同位素標記的雜交探針同時溶于雜交液中進行反應，然后分離雜交雙鏈和未參加反應的探針，用儀器計數(shù)并通過計數(shù)分析雜交結(jié)果。固相雜交是把欲檢測的核酸樣品先結(jié)合到某種固相支持物上，再與溶解于溶液中的雜交探針進行反應，雜交結(jié)果可用儀器進行檢測，但大多數(shù)情況下直接進行放射自顯影，然后根據(jù)自顯影圖譜分析雜交結(jié)果。目前，固相雜交技術(shù)的發(fā)展較快，而且應用范圍更為廣泛。
　　目前使用zui多的固相支持物是硝酸纖維素(NC)膜。它對單鏈DNA有較強的吸附作用。RNA經(jīng)過一些特殊變性劑處理后，也能較容易地結(jié)合到NC膜上。下面介紹固相雜交反應中常用的幾種將核酸樣品轉(zhuǎn)移到膜上的方法。
3.1　點印跡的直接點樣法(Dot blotting)
　　這是一種能快速而且簡便地檢測樣品中微量核酸的常用技術(shù)。其方法主要是將待測樣品直接在NC膜上，然后進行雜交檢測。其主要過程包括膜的處理、點樣、變性、中和、干燥固定以及變性劑去除(檢測RNA法)等。
3.2　DNA轉(zhuǎn)移(Southern blotting)
　　用于點印跡的DNA直接點樣法具簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點，但不能確定特異DNA序列的大小和定位。1975年Southern氏建立了吸附轉(zhuǎn)移法硝酸纖維素膜雜交。其主要原理是利用濾紙對水的毛細管吸附作用，將經(jīng)限制酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分離的的DNA片段轉(zhuǎn)移到固相雜交膜上，此時的DNA片段還保留著原來凝膠中的分布圖式。然后再用探針進行雜交。
3.3　RNA轉(zhuǎn)移(Northern blotting)
　　這是在Southern blot的基礎(chǔ)上發(fā)展的RNA固相雜交技術(shù)，其因兩技術(shù)相類似而得名。其方法與Southernblot一樣。但RNA需先經(jīng)乙二醛等變性劑處理后，再于合適的條件下電泳，這樣便能使充分變性的RNA像變性DNA一樣直接轉(zhuǎn)移到NC膜上。固定之后除去變性劑，再進行雜交，可大大提高雜交的敏感性，每條區(qū)帶所需的RNA量可從500pg降低到1pg以下。
　　此外，由于有時需要分離的核酸樣品分子量很小，用瓊脂糖凝膠不能達到要求的分辨率。這種情況下往往需要聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行分離，而由于這種膠的孔經(jīng)較小，用前述的吸印轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移速度緩慢，易造成轉(zhuǎn)移不*。為了解決之一問題，發(fā)展了電泳轉(zhuǎn)移法。即以電泳的方法使分離后的待測核酸樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜或DBM紙等固相支持物上，再進行雜交。
3.4　用于原位雜交的菌落轉(zhuǎn)移
　　在基因克隆操作中，為了在眾多轉(zhuǎn)化菌落中篩選帶有目的基因的重組克隆，常用的方法是用標記的探針通過原位雜交找出帶有互補序列的目的基因。主要步驟包括長好菌落、制膜、NC膜上菌落的裂解及膜上核酸的固定等。