如果PCR反應條件不能產生所需的特異性產物，可采用新的寡核苷酸重新進 行擴增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物，而后再各自重新擴增進行序列分析。 長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:

　　1.片段大小在80-100bp時，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來 分離。　

　　2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。

　　3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出 來。

　　4.取少量(1-5%)進行第二次擴增，為得到純凈單一的產物，用于第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。

　　5.現已發(fā)現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質。因而，如需重新擴增供Tab聚合 酶測序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。

　　當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時，如來自幾個新近復制的基因，或 重復序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子，可以通過下 列兩種不同方法來改進電泳分離。1).先用只切割某一模板的內切酶進行酶切，而后 電泳純化完整的PCR產物。2).用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統(tǒng)。下 一個部份將討論此類系統(tǒng)中的變性甲酰胺梯度凝膠系統(tǒng)。采用方法一時，必須事先了 解在不同PCR產物中的內切酶位點。

雜合體的直接測序

　　當兩個等位基因由于單一位點突變而產生差異時，用一個PCR引物直接進行測 序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序，將產生復合序列帶(compound sequencing ladders)。有四種 方法可以確定幾種點突在型并從雜合體中獲得單個等位基因的序列:1).克隆分離不同 的模板;2).在測序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術分離不同的模 板;3).在測序反應中只啟動一個等位基因;4).只擴增一個等位基因。

測序模板的制備

　　與PCR產物的直接測序有關的一些問題是變性后由于擴增片段的兩條鏈可以迅速 結合起來，從而阻止了測序引物與它的互補序列退火，或阻止了引物──模板復合物 的延伸。在測序反應中，模板鏈重新結合使一小部份模析驂與測序從而弱化zui終的測 序條帶。為減少此問題，可用改進的標準雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。