實時熒光定量pcr技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。
一. 實時熒光定量PCR原理
　　所謂實時熒光定量pcr技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
　　1.在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（如圖1所示）。

實時熒光定量PCR:一種科學準確的定量方法
圖1. Ct值的確定

2. 熒光域值（threshold）的設定
pcr反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關系

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

實時熒光定量PCR:一種科學準確的定量方法