1、平端連接

通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效 率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為 3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR 產物的效率通過較高，。在采用大量T4dna連接酶并配以5—10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19 的HincⅡ位點進行克隆，以X-gal和IPTG篩選，常可得到足量重組 子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法 克隆PCR產物。

2、粘端連接

引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限制酶切 位點。這樣得到的PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互 補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計 不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產物。其缺點是需要加長 PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5'端多合成3—4個堿基 以利于限制性內切酶與PCR產物末端的穩定結合。即使如此，其酶切 效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變 PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至 數個核苷酸創造出一個限制性內切酶位點。鑒于PCR引物的3'末端序 列的互補性是PCR成功的關鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個或 幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的 長度，而且酶切效果優于5'加端法。對于特定DN***段的克隆，此方 法較為經濟、實用。但對于基因診斷PCR產物的克隆，似乎5'加端法 更為適宜。

3、T4DNA聚合回切產生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在 其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產物在dATP和dTTP 存在的情況下，用T4dna聚合酶進行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產生AccI和XmaI粘性末端(圖1)。 此DN***段直接與用AccI和XmaI切開的載體進行連接。這種方法只需 在PCR引物的5'端加2—4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

4、T-vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個堿 基，所加堿基幾乎全是腺苷。據此，Marchuk等人采用3'端突出一個 胸苷的質粒dna來克隆PCR產物，其克隆效率比平端的連接至少高出 100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3'末端各加一處胸 苷。因為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當僅 一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時， 用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉變成3'末端突出一個胸苷的T尾 載體，稱為T-vector。用這種T-vectorsk可以較有效地直接克隆 PCR產物。Hotton等人也報道了另一種制備T-vector的方法。他們 使用脫氧核苷酸末端轉移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個 胸苷。由于末端轉移酶可以催化多個堿基(ddTTP)作為底物，使平 端載體DNA分子的兩個3'末端各加上一個T。用這種方法制備的T-vector 的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產物的5'末端連接，僅 5'末端可與PCR產物的3'末端形成磷酸二脂鍵。

5、共環消解法：

zui近，Jung等人報道了一種有效的PCR產物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產物，先用T4DNA連接酶催化 連接反應，使5'端帶有限制酶切位點的擴增DN***段連接成共環結 構。然后再用相應的限制酶進行消化，產生粘端DN***段。對于對稱 性限制酶位點，只需在引蛾的5'末端加上一關識別序列，因為在串 接成共環后能恢復限制酶切位點難于切開的缺點，且可用于雙限制 酶切位點的設計，只不過有PCR產物共環化后，僅約1/4的限制酶切 點得以恢復。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。

6、無連接酶亞克隆法(A)

無連接酶克隆法(ligase-free subcloning，LFS)是利用引物5’ 末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點，而是與某一質粒兩 端分別互補的堿基。兩引物的3’端約20—25個核苷酸分別與待擴增 DNA兩翼互補，5’端各有約24個核苷酸分別與線性化質粒的3’端相 同的附加序列。由于線性化質粒的3’端序列各不相同，PCR片段可 以通過選擇各引物的合適5’附加序列與引物3’端定向雜交。

由此物a和b產生的兩端有附加序列的PCR產物與未反應引物分離后， 分別加入兩只含有線性化質粒的反應管中進行第二次PCR。第1管中 用引物a和c，引物a即為*PCR擴增的上游引物a，引物c為下游引 物，與緊鄰5’端附加序列內測的質粒(+)鏈互補。同樣，第2管的 引物為b和d，引物b與*次PCR擴增的下游引物b相同，引物d為上 游引物，與緊鄰5’附加序列內側的質粒(-)鏈互補。

第二次PCR的*循環中，PCR產物與質粒均變性與復性。除自身復 性產物(這種復性產物不被擴增)外，PCR產物與質粒可通過各自3’ 端互補序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3’端互為此物沿 各自互補鏈延伸，結果可產生PCR片段與線性質粒的“連接”。然后 兩管中PCR擴增各進行15—20個循環。這便可產生大量一端管1)或 另一端連接有PCR插入片段的質粒。

第二次PCR后，將第1管與第2管反應液混合，用堿變性雙鏈，中和后 稀釋變性的DNA。反應管中的單鏈DNA可以復性或幾種不同的產物， 除各自本身復性產物外，管1產物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異 源雙鏈DNA，并各自有一較長的5’或3’懸端，這種長的5’或3’懸 端相互互補，在低DNA濃度時可復性產生環化DNA。

盡管這種環化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉化受體大腸 直桿菌。一旦進入體內，兩個缺口便共價連接，修復的質粒即可復 制，下面以從λ噬菌體DNA中擴增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體 中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是* 次PCR時兩引物的5’附加序列不應太短以免影響第二次PCR時異源雙 鏈的形成，以24個核苷酸較為合適。擴增時若形成，引物二聚體， 一定要去除，否則會嚴重影響轉化率。用LFS法已成功地克隆了長達 1.7kb的基因片段。這種方法的優點是：①可用于常規方法無法進行 亞克隆的片段;②適于任何PCR產物和任何質粒;③可亞克隆特殊目 的(如含點突變、缺失或插入等)片段;④在某些情況下，對已構 建了啟動子或增強子等序列的載體，可使待表達片段插入定向合適 位置;⑤較快，可在1d內完成，較常規方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學的重要內容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合 適限制酶切點而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采 用PCR技術行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時間，比之全基 因合成更為經濟和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進行傳染性 疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產物的異性問題和分型問題，采用 產物克隆和測序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準確。隨著 PCR技術的不斷發展和推廣，新的PCR產物的克隆方法也將不斷出現。