其實還是在細胞長滿時、還沒有接觸性抑制之前傳代為好

1、預溫0.25% trypsin， 0.02%EDTA

2、用Ca－free的PBS洗滌貼壁細胞三次

3、用1份0.25% trypsin， 0.02%EDTA和3份PBS室溫下消化（不要用全量消化液因為對于細胞的懸浮作用不但未見有增強作用而且對細胞本身沒有好處）

4、在倒置顯微鏡下觀察細胞懸浮情況，約有半數以上細胞開始漂浮就用移液管（滴管）移出，置入離心管中

5、離心1000rpm，10min

6、上清液移回培養瓶中繼續消化瓶中的剩余未懸浮細胞

7、 離心管底細胞用RPMI1640重懸浮，離心1000rpm，5min去上清

8、再用10%胎牛血清的RPMI1640洗滌離心一次

9、計數后接種到新的培養瓶中

10、未傳代的培養瓶中的細胞＋消化液一起移入離心管中，用RPMI1640和10%胎牛血清的RPMI1640沖洗培養瓶各一次并將液體一并移入離心管中，吹打2次

11、離心1000rpm，5min去上清，再用10%胎牛血清的RPMI1640洗滌離心一次，計數后接種到新的培養瓶中（這樣就像分次收集法，如有污染也不會全軍覆沒）

12、如細胞量不夠或想盡快做完實驗去玩，留住未傳代的培養瓶加上全培去培養，因為瓶底還有細胞沒有被消化下來，這些細胞貼壁能力強增殖活力也強