從技術上說，IHC和ICC實驗并不難，然而，每個實驗又有那么多的變量需要鑒定和優(yōu)化。若運氣不佳，實驗結(jié)果不太好，那么我們可能要做個troubleshooting，看看問題到底出在哪兒。下表就列出了由上海遠慕資深技術解析的IHC/ICC實驗的常見問題，以及相應的對策。
　　
　　問題1：缺乏染色
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　缺乏抗原通過原位雜交檢查蛋白表達。
　　
　　因儲存不當，抗體不起作用按照說明書上的說明儲存。一般來說，將抗體分裝成小份，足夠單次實驗使用。將這些抗體儲存在手動除霜的冰箱中（-20to-70°C），避免反復凍融。
　　
　　一抗或二抗失活獨立檢測報告系統(tǒng)，以評估試劑是否有用。
　　
　　組織固定不足嘗試增加固定時間或換一種固定劑。
　　
　　組織過度固定減少浸潤或固定后步驟的持續(xù)時間。如果浸潤固定無法避免，那么通過抗原修復試劑，讓抗原不被遮蔽。
　　
　　一抗與二抗不兼容使用能與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗來自兔子，那么就使用抗兔的二抗。
　　
　　在固定或包埋過程中表位已改變通過各種抗原修復技術嘗試恢復免疫反應性。
　　
　　在58°C或以下包埋組織。
　　
　　抗原修復不起作用增加處理時間或改變處理溶液。
　　
　　試劑遺漏或順序不對重復染色過程，確認使用了正確的試劑，并以正確順序添加。
　　
　　問題2：高背景
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　一抗或二抗的濃度高滴定抗體，以確定促進一抗和二抗的特異反應所需的zuijia濃度。。
　　
　　組織中抗體和蛋白的疏水相互作用降低抗體稀釋液的離子強度（特別是單克隆抗體）。
　　
　　一抗或二抗與組織的非特異結(jié)合在一抗孵育之前采用封閉步驟（通常使用1%BSA和10%正常驢血清）。脫脂奶粉也是個選擇。
　　
　　二抗的非特異結(jié)合使用交叉反應性IgG被去除的抗體。
　　
　　組織變干在染色過程中避免讓組織變干。
　　
　　離子相互作用引起的背景提高稀釋液的離子強度。
　　
　　問題3：細胞/組織形態(tài)被破壞
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　抗原修復方法太過劇烈根據(jù)經(jīng)驗確定實驗條件，既能保留組織形態(tài)，又能恢復抗原的免疫反應性
　　
　　組織切片從玻片上脫落增加固定時間。根據(jù)經(jīng)驗確定另一種固定劑。
　　
　　組織切片撕裂或折疊。切片下有氣泡重新切片，或在分析結(jié)果時忽略受損區(qū)域。
　　
　　組織形態(tài)的分辨率差切出更薄的組織切片。冰晶可能會破壞冰凍切片的形態(tài)。
　　
　　固定不足在染色過程中會導致組織或細胞受損延長固定時間。提高固定劑/組織的比例。切出更小的組織，以便更*的浸潤。
　　
　　組織自溶導致壞死碎片的染色延長固定時間、比例。考慮使用交聯(lián)的固定劑。
　　
　　問題4：染色不當
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　固定方法不當嘗試另一種固定劑，或延長固定時間。
　　
　　抗原修復可能不當嘗試另一種抗原修復條件。
　　
　　抗原的靜電荷被改變嘗試調(diào)整抗體稀釋液的pH或陽離子濃度。
　　
　　固定拖延導致抗原擴散快速固定組織。嘗試交聯(lián)固定劑，而不是有機固定劑。
　　
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