TFAR19(PDCD5)是由本研究室在上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因,前期的功能研究表明,它是促進細胞凋亡的增強劑.利用熒光素(FITC)標記的TFAR19單克隆抗體為探針,對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn),凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,伴隨著細胞核形態(tài)學(xué)的變化,持續(xù)較長時間,在凋亡小體中仍然可見.

同時我們發(fā)現(xiàn),凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一.進一步的研究證明,凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義,不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉(zhuǎn)位.這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件,提供了一種新的技術(shù)和指標.

(一)TFAR19蛋白的細胞定位分析

材料試劑:

FITC標記的單克隆抗體,pH7.4 、0.15Mol/L PBS,3%的多聚甲醛,PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20),胎牛血清,熒光細胞洗液:pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 .FACS管,Tip頭,移液器.

儀器:低溫水平離心機, 37°C水浴箱,熒光顯微鏡,共聚焦激光掃描顯微鏡,流式細胞計方法:

1 懸浮細胞的染色:

(1)收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細胞(0.5~1′106),PBS洗2次,1000rpm′10min.

(2)3%多聚甲醛冰浴10min,PBS洗2次,1000rpm′10min.

(3)加入PBS-T溶液,37°C孵育15min,PBS洗2次,1000rpm′10min.

(4)加入200ml胎牛血清,室溫反應(yīng)30min.

(5)加入5ml FITC標記的TFAR19單抗(終濃度為1:40),4°C反應(yīng)30min(6)熒光細胞洗液洗2次,1000rpm′10min.

結(jié)果觀察:將細胞沉淀滴片,熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位.同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度.[圖12]

2:貼壁細胞的原位染色

(1) 貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在24孔或6孔板中(內(nèi)有潔凈蓋玻片),讓其爬片生長,待長到50%~80%滿時,凋亡誘導(dǎo)劑處理細胞.

(2) 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色,染色步驟同上.

(3) 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油(5ml)的載玻片上,熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位.

結(jié)果觀察:

3:臨床病理切片的染色、檢測.

4:原代細胞的培養(yǎng)、檢測.

5:分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位(二)TFAR19蛋白的表達與臨床疾病

1. ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下,以及疾病的不同時期,血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平.

材料和試劑:

1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer

2. 洗滌液: pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 203. 封閉液: 3%BSA(用洗滌液配制)

4. 酶標抗體的稀釋:用封閉液稀釋

5. OPD底物Buffer:Na2HPO4.12H2O 1.84g

檸檬酸 0.51g

DDW 100ml

6. 顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用):底物Buffer 10ml

OPD 2mg

30% H2O2 2ml

7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器,ELISAReader(OD490nm),洗板機

操作步驟：

1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜(一般24h以上).

2. 洗滌Buffer洗板三次,加入封閉液,200 ml/well , 37°C孵育2h或4°C過夜.

3. 洗滌Buffer洗板三次,加入不同稀釋度的病人血清(3個重復(fù)孔)100ml/well ,37°C孵育1h.設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照.

4. 洗滌Buffer洗板三次,加入1:2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well,37°C孵育1h.

5. 洗滌Buffer洗板三次,加入顯色液,100 ml/well,避光反應(yīng)10~15min.

6. 加入H2SO4終止反應(yīng),50 ml/well.

7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值,分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平.

2. Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平.