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PCR的試驗污染原因和預防對策

時間:2022/12/15閱讀:525
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PCR的試驗污染
PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與ji高的靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產生。

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污染原因
1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。

2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml),遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可形成假陽性。還有一種容易忽視,最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

4、實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質粒,由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

污染的監測
一個好的實驗室,要時刻注意污染的監測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

1、陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好,經各種鑒定是該產物的標本,如以重組質粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定,檢驗人員心中有數時,在以后的實驗中可免設陽性對照。

2、陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括:
(1)標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。
(2)試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監測試劑是否污染。

3、重復性試驗。
4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增。

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