克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。
(一) 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養細胞懸液(同融合前準備)
② 陽性孔細胞的計數，并調細胞數在1～5×10３／ml
③ 取130個細胞放入6.5ml含飼養細胞*培養液，即20個細胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養細胞的*培養液,細胞數為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養細胞的*培養液，細胞數5個／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。
④ 培養4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加*培養液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在*培養液中加HT。 elisa試劑盒
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液(含有飼養細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液(42℃預熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。
⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔板中進行培養。
⑦ 檢測抗體，擴大培養，必要時再克隆化。
(二) 雜交瘤細胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。
細胞凍存液:
50％小牛血清 elisa試劑盒
40％不*培養液
10％ DMSO(二甲亞砜)
凍存液預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。 elisa試劑盒
