重組質(zhì)粒的篩選是質(zhì)粒構(gòu)建的重要步驟，重組子是篩出來的，這個命題沒有問題。問題是關鍵步驟不在篩選。影響重組質(zhì)粒構(gòu)建效率的關鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關鍵在于切干凈，*的酶切反應是成功的一半，尤其是載體的酶切。

1）  酶切反應的前提是對質(zhì)粒載體的大致定量，一般大小的質(zhì)粒（3－5kb）一次連接的用量在100ng左右，一般挖膠回收的損失在50%左右，為保證一次酶切反應可以進行至少三次連接，質(zhì)粒載體的量在1微克左右較合適。太多的載體用量對酶切效率有負面影響，而太少的質(zhì)粒載體不能保證實驗的需要。

2）  然后使用過量2倍以上的酶量進行反應（按照酶切時間一小時計算，酶活性單位的定義可以參見公司的目錄，一般一個單位的定義是指推薦條件下消化1微克的lambda DNA所需的酶量），反應時間2小時——過夜（不要超過10小時）。我們實驗室一般采用較長的酶切時間，沒有遇到過問題，但是也有實驗室酶切時間控制較嚴格。但是原則是質(zhì)粒載體一定要酶切*。

3）  挖膠回收，現(xiàn)在很多的國產(chǎn)試劑盒可以保證50％以上的回收效率。采用低熔點膠或電洗脫也是很多實驗室的選擇。

4）  連接，關鍵點是載體和片斷的比例以及用量。對于定向克隆片斷與載體的摩爾比一半大于2，非定向克隆一般大于5－10。一般大小的質(zhì)粒載體（3－5kb）一次連接的用量在100ng左右。膠回收后建議對載體和片斷進行定量。連接反應我們一般使用NEB的連接酶或Takara的ligation 試劑盒，這兩種產(chǎn)品允許快速連接。其它很多公司的普通連接酶也不錯。

5）  在影響克隆效率的諸多因素中酶切效率是為關鍵的步驟，因為酶切不*導致的空載體背景是絕大多數(shù)克隆操作失敗的原因，極少數(shù)酶切反應不*的產(chǎn)物可能在轉(zhuǎn)化后形成非常高的空載體背景。對于非定向克隆來說，堿性磷酸酶消化是另一非常關鍵的步驟，但是這也是在建立在酶切反應*的前提之下。
重組子篩選時，對于定向克隆我們一般挑取的菌斑數(shù)為4個，對于非定向克隆，我們一般挑取8個，如果篩不到重組子，我們一般從酶切載體開始重做，因為我們發(fā)現(xiàn)，4－8個菌落中挑不到重組子時，繼續(xù)篩選所費的努力通常得不償失。