“微球粒徑怎么選？”

“微球沉淀了怎么辦？”

“微球偶聯采用兩步法進行？”

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承蒙大家的關照，選擇微球作為標記材料來開發免疫層析產品。

今天，古朵生物小編特意為大家精選了14個在實操過程中，常見、具代表性的問題，由于篇幅問題，本次先上7個問答，來看看里面是不是也有你遇到的問題！

Q1：在免疫層析實驗中，微球粒徑如何選擇？

A1：一般情況下，使用的微球粒徑在100nm-400nm之間，其中常用的是200nm和300nm粒徑的微球。

Q2：微球中的羧基基團是在微球的內部還是在微球的表面？

A2：有部分基團會被包埋在微球的內部，但是微球是無孔的，我們平時所說的羧基含量是指滴定的微球表面的羧基基團含量，這些基團是可以直接用于共價偶聯配體的。

Q3：微球在離心后回收率很低，該如何解決？

A3：一般情況下，微球在離心后丟失有可能是因為洗滌后隨著表面活性劑濃度的降低，微球的疏水性增強從而使其聚集后粘附在管壁兩側，可以增加離心力或者添加表面活性劑來促進微球沉淀。

Q4：在微球沉淀之后，使用超聲的方式進行重懸過程中有什么好的建議？

A4：微球的分散可以使用水浴超聲的方式進行，這種方式可以有效的使微球分散但又不會使溶液發熱，同時選擇水浴超聲的另一優勢是不會像探頭插入式超聲那樣因為使用次數的增多而導至探頭污染的可能。

我們沒有發現偶聯有蛋白的微球超聲時會有什么問題，但是需要注意的是如果偶聯有蛋白的微球超聲時間過長的話也會使偶聯的蛋白脫落。

Q5：如何可以知道在微球洗滌過程中沒有被污染？

A5：首先應該確保所使用的水是干凈無污染的（沒有離子、沒有有機物、沒有微生物等），否則的話微球可以在洗滌過程中吸附水中的雜質。建議使用經0.2um濾膜過濾且無污染的去離子水，同時在洗滌時用顯微鏡對微球進行檢測確認微球處于單分散狀態。

Q6：稀釋濃度較高的微球，一般使用的稀釋液是什么？

A6：一般使用去離子水稀釋微球，當然也可以使用某些緩沖液，如偶聯抗體前則可以選擇偶聯緩沖液對微球進行洗滌和稀釋。

Q7：在羧基微球偶聯抗體時是推薦一步法還是兩步法偶聯？

A7：簡單的回答是推薦兩步法進行偶聯。

一步法的缺點是反應溶液的pH值是一個均值，另外大的缺點是水溶性的碳化二胺既可以結合蛋白同時也可以將所有物質結合在一起，因此很容易使得微球發生團聚，形成的沉淀大小無法控制且分布不均。

兩步法包括在低pH條件下使微球和水溶性的碳化二胺反應，羧基形成活化中間體，然后洗滌去除未反應的碳化二胺。需要注意的是羧基活化后的中間體不穩定，容易發生水解，因此洗滌的過程必須快速以減少活化基團的水解。當加入抗體后需要調整溶液的pH值（pH＞8）使抗體的氨基基團處于游離狀態。在偶聯反應完成之后，通過洗滌將未結合的抗體去除干凈。雖然兩步法的步驟更多了，但可以更好的控制反應的每個過程從而避免微球發生凝集。

如果您仍然想要使用一步法進行偶聯反應，那么我們推薦您可以做一些適當的調整：

1. 計算出需要被活化的基團的數量；

2. 加入過量的水溶性碳化二胺將所有基團進行活化，室溫下反應時間0.5；

3. 計算出需要偶聯到微球上的抗體的數量；

4.加入過量的抗體到已活化的微球中進行反應；這種方法只允許微球和抗體之間發生結合反應，而不允許抗體和抗體之間以及微球和微球之間發生結合反應。

以上問答是我們基于自己的經驗所整理，若有不同見解，歡迎交流！