一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過(guò)對(duì)好氣性自生固氮菌的計(jì)數(shù)，了解稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)（MPN）的原理和方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

-大或然數(shù)(most probable number，MPN)計(jì)數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢(shì)，但卻具有特殊生理功能的類群。其特點(diǎn)是利用待測(cè)微生物的特殊生理功能的選擇性來(lái)擺脫其他微生物類群的干擾，并通過(guò)該生理功能的表現(xiàn)來(lái)判斷該類群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測(cè)定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細(xì)菌等。見附表23-1）的數(shù)量和檢測(cè)污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的數(shù)量，缺點(diǎn)是只適于進(jìn)行特殊生理類群的測(cè)定，結(jié)果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計(jì)數(shù)時(shí)才采用。

MPN計(jì)數(shù)是將待測(cè)樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量（如lm1）的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒(méi)有或極少出現(xiàn)生長(zhǎng)繁殖。根據(jù)沒(méi)有生長(zhǎng)的-低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的-高稀釋度，采用“大或然數(shù)”理論，可以計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。具體地說(shuō)，菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，一定量菌液中細(xì)菌可以極少或無(wú)菌，然后每個(gè)稀釋度取3—5次重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，將有菌液生長(zhǎng)的后3個(gè)稀釋度（即臨界級(jí)數(shù)）中出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)，由大或然數(shù)表（見附錄九）上查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第1位數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌數(shù)。

如某一細(xì)菌在稀釋法中的生長(zhǎng)情況如下；

稀釋度          lO-3    10-4    10-5    lO-6    10-7   10-8

重復(fù)數(shù)           5      5      5      5      5     5

出現(xiàn)生長(zhǎng)的管數(shù)   5      5      5      4      1     0

根據(jù)以上結(jié)果，在接種lO-3—10-5稀釋液的試管中5個(gè)重復(fù)都有生長(zhǎng)，在接種lO-6稀釋液的試管中有4個(gè)重復(fù)生長(zhǎng)，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個(gè)生長(zhǎng)，而接種10-8稀釋液的試管全無(wú)生長(zhǎng)。由此可得出其數(shù)量指標(biāo)為“541”，查大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第1位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)＝17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個(gè)。

在確定數(shù)量指標(biāo)時(shí)，不管重復(fù)次數(shù)如何，都是3位數(shù)字，第1位數(shù)字必須是所有試管都生長(zhǎng)微生物的某一稀釋度的培養(yǎng)試管，后兩位數(shù)字依次為以下兩個(gè)稀釋度的生長(zhǎng)管數(shù)，如果再往下的稀釋仍有生長(zhǎng)管數(shù)，則可將此數(shù)加到前面相鄰的第三位數(shù)上即可。

如某一微生物生理群稀釋培養(yǎng)記錄為：

稀釋度           lO-1      10-2     10-3     lO-4     10-5     10-6

重復(fù)數(shù)            4       4       4      4       4       4

出現(xiàn)生長(zhǎng)的管數(shù)    4       4       3      2       1       0

以上情況，可將后一個(gè)數(shù)字加到前一個(gè)數(shù)字上，即數(shù)量指標(biāo)為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×102個(gè)。按照重復(fù)次數(shù)的不同，大或然數(shù)表又分為三管大或然數(shù)表、四管大或然數(shù)表和五管大或然數(shù)表。

應(yīng)用MPN計(jì)數(shù)，應(yīng)注意兩點(diǎn)，一是菌液稀釋度的選擇要合適，其原則是-低稀釋度的所有重復(fù)都應(yīng)有菌生長(zhǎng)，而-高稀釋度的所有重復(fù)無(wú)菌生長(zhǎng)。對(duì)土壤樣品而言，分析每個(gè)生理群的微生物需5—7個(gè)連續(xù)稀釋液分別接種，微生物類群不同，其起始稀釋度不同(見附表1)；二是每個(gè)接種稀釋度必須有重復(fù)，重復(fù)次數(shù)可根據(jù)需要和條件而定，一般2—5個(gè)重復(fù)，個(gè)別也有采用2個(gè)重復(fù)的，但重復(fù)次數(shù)越多，誤差就會(huì)越小，相對(duì)地說(shuō)結(jié)果就會(huì)越正確。不同的重復(fù)次數(shù)應(yīng)按其相應(yīng)的大或然數(shù)表計(jì)算結(jié)果。

若要求出土樣中每克干土所含的活菌數(shù)，則要將前述兩例中所得的每毫升菌數(shù)除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（烘干后的土樣質(zhì)量／原始土樣的質(zhì)量）。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1. 土壤樣品：肥沃菜園土

2. 培養(yǎng)基：阿須貝（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)液(附錄三、15)22管(每管裝5ml，加1cm×4.5cm濾紙l條)

3. 器材：90ml無(wú)菌水（裝入250 ml三角瓶中，并裝有15—20個(gè)玻璃珠）、9ml無(wú)菌水、lml刻度無(wú)菌吸管、試管架、記號(hào)筆。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1．稱取10克土樣，放入90ml無(wú)菌水中，振蕩20min，讓菌充分分散，然后按十倍稀釋法將供試土樣制成10-1—10-6的土壤稀釋液。

2．將22支裝有Ashby無(wú)氮培養(yǎng)液的試管按縱4橫5的方陣排列于試管架上，第1縱列的4支試管上標(biāo)以10-2，第二縱列的4支試管上標(biāo)以10-3……第五縱列的4支管上際以10-6（即采用5個(gè)稀釋度，4個(gè)重復(fù)），另外2支試管留作對(duì)照。

3． 用lml無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取10-6的土壤稀釋液各lml放入編號(hào)10-6的4支試管中，再吸取10-5稀釋液各lml放入編號(hào)10-5的4支試管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀釋液各lml放入各自對(duì)應(yīng)編號(hào)的試管中。對(duì)照管不加稀釋液。

4．將所有試管置28—30℃培養(yǎng)7天后觀察結(jié)果。

5．精-確稱取3份10克稀釋用土，放入稱量瓶中，置105-110℃烘2h后放入干燥器中，至恒重后稱重，然后計(jì)算干土在土樣中所占的質(zhì)量份數(shù)。

五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：

培養(yǎng)7天后，取出試管，檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

凡有固氮菌生長(zhǎng)的試管，則培養(yǎng)液與濾紙接觸處有黑褐色或粘液狀菌膜，即為陽(yáng)性，否則為陰性。對(duì)照管應(yīng)為陰性。依次檢查每管生長(zhǎng)情況，將結(jié)果填入下表，計(jì)算每克干土所含的活菌數(shù)。