WB 是實驗室常見實驗之一，蛋白定量后，上樣之前，還需要哪些步驟制樣呢？

1. 蛋白含量測定后，古朵生物建議大家把各個樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可使用 PBS，水或裂解液），等體積等質(zhì)量上樣，計算上樣體積時需包含 loading buffer 的體積。

例如：把所有蛋白濃度都稀釋到 2ug/ul，然后與 2Xloading buffer 1:1 混合后，濃度成為 1ug/ul，建議上樣 20-30ul 即可。

2. 與 loading buffer 混勻后，要將樣品在沸水中煮 3-5 分鐘，使蛋白充分變性。也可使用 PCR 儀 95°加熱 5 分鐘。

PS：煮沸并非必須步驟，有些蛋白僅需 70℃ 煮或無需煮沸，具體請參照抗體要求操作。

3. 煮沸后在冰上靜置少許時間后進(jìn)行低速離心，即可上樣。剩余樣品建議分裝后保存，樣品可以在 4℃ 冰箱短時間保存，也可以在-20 或-80℃ 保存，解凍后可重新煮沸上樣。


SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中樣品為什么要加 loading buffer？

loading buffer 的功能，第一，含有指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF 起到指示的作用，顯示電泳的進(jìn)程，以便我們適時終止電泳；第二，成分中的甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于 Tris   或者其他緩沖液，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔；第三，loading buffer 中 SDS 是比較強的陰離子表面活性劑，與蛋白質(zhì)表面結(jié)合，覆蓋蛋白質(zhì)本身的電荷性質(zhì)，使之表面帶負(fù)電荷。SDS 還可以破壞維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的重要因素--疏水鍵，使蛋白質(zhì)解構(gòu)。2-ME 和 DTT 是比較強的還原劑，可以打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵, 使蛋白質(zhì)亞基分離。

上樣之前煮沸的目的是什么？

煮沸樣品的目的是為了更好地將蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)打開。在溫度高時，一方面維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的各種作用力減弱，另一方面促進(jìn) SDS 的電荷覆蓋和疏水鍵打開作用。通過上樣 buffer 和加熱的處理，蛋白樣品呈現(xiàn)帶負(fù)電荷的長鏈（還原電泳），在電泳時的分子篩效應(yīng)使得泳動只和蛋白質(zhì)大小有關(guān)（也就是表觀分子量），與蛋白形狀無關(guān)。