我們在建立一種ELISA方法時，對于抗原抗體最適工作濃度的選擇是非常重要的，不僅可以快速摸索出ELISA的*條件，還可以節約測定時間和成本。
下面以夾心法測抗原為例，介紹最適工作濃度的選擇方法。
a)用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，濃度分別為10ug/ml、5.0ug/ml、2.5ug/ml、1.0ug/ml, 包被酶標板，每一濃度包被1橫行，每孔100ul。4 ℃過夜包被，洗滌3次；
b)5%脫脂奶粉封閉酶標板， 37℃孵育1h，洗滌3次；
c) 在每條包被孔中加入空白對照和標準品，每個空白對照和標準品為一組，依次加入，各100ul，37℃孵育1h，洗滌3次；
d) 在每一包被濃度的一挑中分別加入按1:2000、1：4000、1：8000、1:16000 稀釋的兔多抗， 37℃孵育1h，洗滌3次；
e) 在每一包被濃度的一條中分別加入HRP標記羊抗兔igG，稀釋度先按說明書上的推薦稀釋比進行稀釋，37℃孵育30min，洗滌5次；
f) 加TMB底物，37℃避光顯色10-15min，用2mol/L H2SO4終止反應，酶標儀450nm讀取吸光度（OD）值；
g) 測得的標準品OD值在2.0左右，陰性對照OD值小于0.1的組合為較理想的組合。
可根據初步確定的濃度縮小間距,再做進一步棋盤滴定,尋找最佳包被條件。
注意：抗體做稀釋時最好用同一個原始濃度做倍比稀釋，這樣可以盡量減少由于加樣槍造成的誤差及人為誤差。
加樣方法參考下表：
注：1. 1,2,3,4條分別包被不同濃度單抗，如紅色框所示；2.縱列分別加入標準品和blank孔，相應加入稀釋好的多抗；3.整板加入推薦稀釋比的二抗。
典型數據舉例如下:如 h.il-6，參考范圍300pg/ml。
| 300pg/ml | 0 | 300pg/ml | 0 | 300pg/ml | 0 | 300pg/ml | 0 |
| 10ug/ml | 4.548 | 0.66 | 4.732 | 0.458 | 4.085 | 0.401 | 3.988 | 0.347 |
| 5ug/ml | 3.433 | 0.627 | 3.201 | 0.425 | 2.829 | 0.349 | 2.566 | 0.277 |
| 2.5ug/ml | 3.278 | 0.54 | 2.84 | 0.426 | 2.553 | 0.233 | 1.978 | 0.16 |
| 1ug/ml | 2.756 | 0.24 | 2.102 | 0.09 | 1.8 | 0.085 | 1.256 | 0.056 |
| 1:2000 | 1:4000 | 1:8000 | 1:16000 |
由此表可以看出，選擇包被1ug/ml，多抗用1:4000，效果甚佳。
相信經過對棋盤滴定的掌握，各種ELISA試劑盒方法建立已不成問題。
