化學發光是利用化學反應產生的能量促使產生能級躍遷，從而發光，典型的如魯米諾檢測血跡；熒光是一種光致發光現象，必須提供光源去激發分子產生能級躍遷，進而發光。使用上述兩種方法進行免疫分析時，其區別很明顯，化學發光無需外加光源，背景干擾小；而熒光則需要外加光源，在垂直光源的方向上檢測，生物樣品中的蛋白質、氨基酸等分子也會產生背景熒光，背景稍高一些，需要選擇合適的熒光試劑，以及樣品處理方法以減少非特異性吸附蛋白的影響。免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。  在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量 。　  用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術，以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術。 　　免疫熒光細胞化學分直接法、夾心法、間接法和補體法。 　　一、直接法 　　1．檢查抗原法 這是最早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應抗原結合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現特異性熒光。此法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差　2．檢查抗體法 將抗原標記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細胞或組織內相應抗體反應，而將抗體定位檢測出來。 　　二、間接法 　　1．檢查抗體法（夾心法）　　此法是先用特異性抗原與細胞或組織內抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞內抗體上的抗原相結合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。 　　2．檢查抗體法　　用已知抗原細胞或組織標本的切片，加上待檢血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性igg熒光抗體）與結合在抗原上的抗體反應（如檢測人血清中的抗體必需用抗人igg熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段  間接法 　　3．檢查抗原法雙薄片　　此法是直接法的重要改進，先用特異性（對細胞或組織內抗原）抗體（或稱第一抗體）與細胞標本反應，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體，種特異性）與結合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。由于結合在抗原抗體復合物上的熒光抗全顯著多于直接法，從而提高了敏感性。    如細胞抗原上每個分子結合3～5個分子抗體，當此抗體作為抗原時又可結合3～5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強3至4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示。這是現在*泛應用的技術。  三、補體法 　　1．直接檢查組織內免疫復合物法　　用抗補體c3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原抗體補體復合物---抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現陽性熒光的部位就是免疫復合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。2．間接檢查組織內抗原法　　常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經37℃孵育后，如發生抗原補體抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原抗體—抗補體熒光抗體的復合物，此法優點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標記顯示。 　　四、雙重免疫熒光標記法 　　在同一細胞組織標本上需要同時檢查兩種抗原時，要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗a和抗b）以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗a抗體用異硫氰酸熒光素標記，發黃綠色熒光；抗b抗體用tmritc或rb200標記，發紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。 　　五、對照試驗 　　為了保證免疫熒光細胞化學染色的準確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗時進行以上對照試驗： 　　1．直接法　需設下述對照試驗 　　（1）標本自發熒光對照：標本只加pbs或不加pbs，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光）。 　　（2）抑制試驗：可分為二步法和一步法。 　　①二步抑制法：標本先加未標記的特異性抗體，再加標記熒光抗體，結果應呈陰性或明顯減弱的熒光。 　　②一步抑制法：先將熒光抗體用未標記抗體作適量混合，再加在標本上染色，結果應為陰性。此法效果較二步法好，并且簡便。 　　（3）陽性對照：用已知陽性標本作直接法免疫熒光染色，結果應呈陽性熒光。 　　如對照（1）和（2）無熒光或弱熒光，（3）和待檢查標本呈強熒光即為特異性陽性熒光。 　　2．間接法 　　（1）自發熒光對照：同上（一）。 　　（2）熒光抗體對照：標本只加間接熒光抗體染色，結果陰性。 　　（3）抑制試驗：同上。 　　（4）陽性對照：同上。 　　如對照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對照和待檢標本陽性則為特異性熒光。 　　3．補體法 　　（1）自發熒光對照 　　（2）熒光抗體對照 　　（3）抑制試驗 　　（4）補體對照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用標本，再用抗補體熒光抗體染色，結果陰性。 　　（5）抑制試驗：標本加滅活的第一抗體，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結果應為陰性。 　　（6）陽性對照：（1）～（5）結果陰性，（6）和待檢標本陽性時，則為特異性熒光。