技術(shù)分享| 免疫球蛋白IgG的分離與提純

　　免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表著機體體液免疫的水平，并進一步代表著B細胞的功能，因此測定血清Ig含量可以推知機體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。

　　隨著免疫學(xué)的發(fā)展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數(shù)采用二步法以上相結(jié)合的方法，特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A(chǔ)，再經(jīng)過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。

　　硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來(稱為鹽析)。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同，利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提，為了獲得純化的免疫球蛋白成分，必須進一步采用層析的方法進行分離。

　　免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

　　IgG的分離與提純

　　(一)材料與試劑配制

　　1.動物血清

　　2.硫酸銨飽和溶液 硫酸銨 800g~850g H2O 1 000ml 加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28%NH4OH調(diào)pH至7.0(不調(diào)pH值也可以)。

　　注：硫酸銨以質(zhì)量優(yōu)者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過夜后濾過，加熱蒸發(fā)H2S即可。

　　3.0.01Mol/L pH7.4PB 液

　　4.1%BaCl2溶液

　　5.納氏液 HgI 115.00g KI 80.00g 加H2O 至 500.00ml

　　溶化后過濾，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

　　6.0.50 Mol/L的HCl液和 0.50 Mol/L的NaOH液。

　　7.洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。

　　8.透析袋(或玻璃紙)。

　　(二)操作方法

　　1.取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20%(NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置 30min。

　　2.3 000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。

　　3.在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30ml，使成50%((NH4)2SO4溶液，充分混合，靜置30min。

　　4.3 000r/min離心20min，棄上清。

　　5.于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液 10ml，使成33%(NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。

　　6. 3 000r/min 離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2~3次。

　　7. 用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。

　　8. 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次。以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4+(取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現(xiàn)磚紅色即認為有NH4+存在)，直至無 SO42-或NH4+出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。

　　9. 離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為粗提IgG (即γ球蛋白，如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。

　　10.過DEAE-纖維素層析柱。(裝柱過程見層析技術(shù))。以 0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。

　　11.蛋白質(zhì)及其定量鑒定。

　　12.IgG的純度鑒定 可采用下列方法之一鑒定。

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