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葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)已成為研究植物光合生理、表型分析等的bi備儀器技術(shù)，如今市面上有很多自稱可以進行葉綠素?zé)晒獬上竦脑O(shè)備，既有進口的，也有國產(chǎn)的，其中不乏存在一些忽悠、故弄玄虛、產(chǎn)品不成熟甚至存在嚴(yán)重缺陷并不被學(xué)術(shù)界認(rèn)可（沒有權(quán)威的參考文獻做支撐甚至根本沒有參考文獻）等問題，宣傳彩頁或者含糊其辭、或者亂加引用其它儀器技術(shù)的參考文獻圖片、甚至作假圖片等。如果購買了這樣的儀器設(shè)備，實驗成果很可能存在錯誤或漏洞和誤導(dǎo)、很難在國際學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表等問題。本文主要針對葉綠素?zé)晒鈩討B(tài)成像技術(shù)，就如何選配葉綠素?zé)晒獬上駜x器設(shè)備問題做一簡單介紹，所介紹的儀器設(shè)備都是國際上學(xué)術(shù)界普遍采用的、每年都借以發(fā)表大量文獻、被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可的技術(shù)產(chǎn)品。

一、葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的發(fā)展

1、傳統(tǒng)葉綠素?zé)晒鈨x

 20世紀(jì)八九十年代，葉綠素?zé)晒鈾z測技術(shù)逐漸成熟。目前主流的商用葉綠素?zé)晒鈨x主要有以下三大技術(shù)路線：

• 連續(xù)激發(fā)式（非調(diào)制式）熒光儀Direct Fluorometer，測量OJIP快速熒光曲線

• 脈沖調(diào)制式熒光儀Pulse Amplitude Modulated Fluorometer，測量穩(wěn)態(tài)熒光與熒光淬滅曲線

• 雙調(diào)制式熒光儀Double-Modulation Fluorometer，時間分辨率2μs，測量快速熒光誘導(dǎo)曲線，如QA–再氧化動力學(xué)曲線、S-state狀態(tài)轉(zhuǎn)換等，同時兼容調(diào)制式與連續(xù)激發(fā)式

從左至右：OJIP快速熒光動力學(xué)曲線、PAM熒光淬滅動力學(xué)曲線、QA–再氧化動力學(xué)曲線（Kalaji, 2014）

     其中FL6000（原FL3500）雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x無疑是目前功能最全面、性能最強的一類葉綠素?zé)晒鈨x。而最新技術(shù)可以在手持式小型儀器（FluorPen/AquaPen）中融合PAM脈沖調(diào)制和OJIP兩類測量技術(shù)，并集成PAR光合有效輻射和OD光密度傳感器，甚至可以在國際空間站上進行科研工作。

上圖：FL6000雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x；下左圖：FluorPen/AquaPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x；下右圖：NASA宇航員使用FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x在國際空間站新一代先進植物培養(yǎng)器（Advanced Plant Habitat，APH）中進行測量

2、葉綠素?zé)晒鈨x的局限性

在多年的儀器使用研究之后，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)了葉綠素?zé)晒鈨x有一些難以解決的局限性。

• 葉綠素?zé)晒鈨x僅能通過光纖測量樣品的一個點，無法展示樣品不同部位、結(jié)構(gòu)的差異，更難以研究脅迫受損組織的分布以及受損部分和健康部分的差異。測量結(jié)果還容易因為不同部位間的差異造成誤差。

• 熒光儀只能獲得熒光數(shù)據(jù)和動力學(xué)曲線圖，難以展現(xiàn)實驗處理在樣品上的分布情況。

• 熒光儀要求測量樣品盡量平整，基本上只能測量葉片或者藻液，很難測量果實、花朵、果穗、種子、特殊植物器官（如捕蟲器官）、整株植物和冠層等，微觀上也不能測量單個微藻或植物細胞乃至單個葉綠體。

• 面對大量小型樣品時，使用熒光儀一次只能測量一個樣品，工作量極大；而且很難直觀比對樣品間的差異。

左圖：僅能測量一點的葉綠素?zé)晒鈨x無法全面反映植物的情況；右圖：葉綠素?zé)晒鈨x的結(jié)果僅能反映測量點的狀況

左圖：葉綠素?zé)晒鈨x難以測量的植物樣品；右圖：面對大量小型樣品時，熒光儀經(jīng)常無能為力

3、葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的出現(xiàn)與成熟

   隨著Charge-Coupled Device(CCD)相機技術(shù)、電腦圖像分析技術(shù)以及LED光源板技術(shù)的成熟，從上世紀(jì)八十年代末開始，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)開始逐漸發(fā)展起來（Daley et al.1989; Raschke et al. 1990; Mott et al. 1993; Genty and Meyer 1994; Bro et al. 1995; Siebke and Weis 1995; Meyer and Genty 1998; Balachandran et al. 1994; Oxborough and Baker 1997；Nedbal 2004）。但這些研究一直局限于研究者實驗室使用，難以商業(yè)推廣，技術(shù)上也不成熟。

   Ladislav Nedbal與Martin Trtilek等于20世紀(jì)90年代末期發(fā)明了與PAM技術(shù)相結(jié)合的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)（他們同時也是FL6000雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的發(fā)明者），研制成功了第一臺FluorCam脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上駜x（Nedbal，2000）并推出其商用型號。無論是葉綠素?zé)晒鈾?quán)威書籍《Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis》（Nedbal也是本書的合作作者之一），還是引用次數(shù)高達4600的葉綠素?zé)晒庋芯烤C述《Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In Vivo》都將FluorCam調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的出現(xiàn)作為葉綠素?zé)晒庋芯空嬲M入二維時代的里程碑。之后又出現(xiàn)了多個葉綠素?zé)晒獬上裆逃脙x器，其中有些品牌現(xiàn)在已經(jīng)銷聲匿跡。而FluorCam還一直是葉綠素?zé)晒庋芯康膬?yōu)中之選，更是愈來愈發(fā)展壯大，已成為shi界上公認(rèn)的權(quán)威植物光合生理與表型分析研究儀器。

左圖：FluorCam葉綠素?zé)晒獬上駜x的最初設(shè)計與其發(fā)明者；右圖：目前FluorCam的主要型號

二、如何選配葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)

在選配儀器時，我們都要考慮這樣兩個相互關(guān)聯(lián)的問題：

• 如何根據(jù)實驗設(shè)計選擇適用的葉綠素?zé)晒獬上駜x器的型號和配置？

• 如何分辨葉綠素?zé)晒獬上駜x器的優(yōu)劣？

那么，面對廠家的宣傳，我們應(yīng)該如何確定真正技術(shù)優(yōu)秀又適用于自己的儀器呢？我們可以從以下四點逐一考察：

• 文獻發(fā)表情況

• 成像質(zhì)量：熒光激發(fā)光源、成像傳感器與實際成像圖

• 軟件功能：測量參數(shù)及對應(yīng)成像圖處理、無人值守自動測量等

• 擴展成像功能

1、文獻發(fā)表情況

   在進行實驗設(shè)計之前，我們都需要閱讀大量的文獻。這不但是為了從前人的研究中獲得實驗思路和靈感，也是為了從文獻中發(fā)現(xiàn)測量數(shù)據(jù)精確可靠、國際認(rèn)可度高的儀器。這從發(fā)表文獻的數(shù)量和質(zhì)量上可以有一個直觀的認(rèn)識。

   2019年-2021年，每年使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)發(fā)表的SCI文獻都保持在150篇以上。2022年更是達到200篇以上。其中國內(nèi)科研院所利用FluorCam發(fā)表文獻量占比也在逐年攀升。這既說明中國科學(xué)家對FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)有極大的認(rèn)可度，也說明中國的光合相關(guān)研究處于領(lǐng)先水平。

左圖：使用FluorCam發(fā)表SCI文獻的逐年趨勢圖；右圖：部分文獻中的熒光成像圖

   這些發(fā)表的文獻中，中科院SCI期刊分區(qū)一區(qū)文獻（按文獻發(fā)表當(dāng)年的中科院SCI期刊分區(qū)進行統(tǒng)計）數(shù)量同樣穩(wěn)中有進。2020年至2023年5月，一區(qū)文獻發(fā)表量占同期全部發(fā)表文獻量的30%。這其中包括發(fā)表于The Plant Cell、Nature Communications、Nature Plants、Cell、PNAS、Molecular Plant、New Phytologist、Plant Physiology等頂級期刊的文獻。說明FluorCam技術(shù)發(fā)表文獻的研究水平之高。

2、成像質(zhì)量：熒光激發(fā)光源、成像傳感器、實際成像圖

  1）熒光激發(fā)光源：光質(zhì)（顏色）、成像面積、光強、光場均勻度

   葉綠素?zé)晒鉁y量必須要用專門的熒光激發(fā)光源來激發(fā)熒光。根據(jù)用途，激發(fā)光分為測量光、光化學(xué)光和飽和脈沖光。在目前主流的葉綠素?zé)晒獬上駜x器中，這些激發(fā)光都來源于儀器配備的LED光源板。

   從光質(zhì)（顏色）上來說，從紫外光到紅光都可以激發(fā)葉綠素?zé)晒狻５夂仙兀òㄌ炀€色素和光反應(yīng)中心的葉綠素a）有其特定的吸收峰，因此葉綠素?zé)晒鈨x器一般使用的光質(zhì)為：

• 紅光、藍光：對應(yīng)葉綠素和類胡蘿卜素的吸收峰，也可用于研究植物對不同光質(zhì)的響應(yīng)

• 白光：模擬自然光；兼顧各種光合色素

• 其他波段光源：針對特定樣品，比如紅藻、褐藻等可選用590 nm琥珀光

   具體到每種激發(fā)光，測量光是用來測量最小熒光F₀，而在激發(fā)F₀時，要求光反應(yīng)中心不產(chǎn)生電荷分離和熱耗散，因此能級較低的紅光就是*好的選擇。飽和脈沖光用來暫時關(guān)閉光系統(tǒng)反應(yīng)中心，因此高能級的藍光或全光譜的白光更為合適。光化學(xué)光用來在測量過程中誘導(dǎo)植物發(fā)生光合作用，也就是模擬自然光照，因此紅光藍光均可，但*好的光質(zhì)無疑還是更接近真實自然光照的白光。

左圖：不同光合色素的吸收光譜；右圖：不同光質(zhì)激發(fā)葉綠素?zé)晒獾倪^程

由此推薦的光源配置如下（有的葉綠素?zé)晒獬上駜x器只能配備一種顏色的光源，那就沒有辦法了）：

• 測量光：紅光

• 光化光：紅光、藍光或白光（至少一種，可配多種，白光更接近真實條件）

• 飽和脈沖光：白光或藍光（一般一種即可）

   FluorCam可以在一臺儀器中同時配備紅光+白光和紅光+藍光的雙色光源，還可以定制青光、綠光、琥珀光、深紅光、紫外光等各種不同光質(zhì)的光源，而且每種光源均為專用的均勻陣列光源板，實現(xiàn)熒光激發(fā)的最優(yōu)化。

FluorCam系統(tǒng)配備的雙色與多色LED光源板

   同時，光源板的面積又是最佳成像面積的決定因素。FluorCam系統(tǒng)具備一系列不同成像面積的型號，從用來進行細胞級微觀熒光測量的顯微鏡，到進行大型作物與冠層測量35×35cm成像面積的大型平臺，均配備的專門對應(yīng)設(shè)計的LED光源板。

針對不同大小的樣品，專門設(shè)計的FluorCam型號

   而光強、面積、光場均勻度這三個方面是相互聯(lián)系的。光化學(xué)光一般要求最高達到1500-2000 µmol/m².s，飽和脈沖光一般要求最高達到3000-5000 µmol/m².s。但由于葉綠素?zé)晒獬上袷窃谝粋€二維空間上進行同步檢測的，因此就要求在一定的成像面積上達到足夠的光場均勻度。那么這個光場均勻又能保證足夠光強的成像面積是由什么決定的？這絕不是廠家宣傳資料上隨便說的，這需要一系列軟硬件技術(shù)的支持。

   首先，點光源的光場必然會隨距離衰減。因此對于葉綠素?zé)晒獬上駜x器使用的光源板必須是均勻排列的LED陣列，而且每塊LED光源板的面積至少要和成像面積一樣大。這樣點光源陣列的光場疊加才能保證相同成像面積中的光場是均勻的。如果光源陣列本身就不是均勻的，那么怎么可能保證光場是均勻的呢？

左圖：點光源光場；中圖：均勻點光源陣列的光場示意圖；右圖：某葉綠素?zé)晒獬上駜x器品牌的非均勻光源板

   但由于光源光場的邊際效應(yīng)，僅僅這樣還是不夠的。為了獲得更好的成像效果還需要有更進一步的技術(shù)保障。一種方法是使用兩塊同等面積的LED光源板各自斜向45°相對排列，使同等面積上疊加的LED數(shù)量提高一倍。比如FluorCam開放式和封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)就是使用這種方法，4塊13×13或20×20cm的光源板兩兩成組，保證相應(yīng)成像面積中光場的均勻度。另一種方法是增加光源板的面積。比如FluorCam大型葉綠素?zé)晒獬上衿脚_使用大于70×70cm的光源板來確保成像中心35×35cm的光場均勻度。

左圖：FluorCam開放式的4塊成組對向安裝的光源板，中圖與右圖：FluorCam大型成像平臺的70×70cm光源板和實際測量情況

 2、成像傳感器

   目前主要的成像傳感器有CCD和CMOS兩種。兩種傳感器各有優(yōu)劣。目前，熒光成像類儀器是以CCD傳感器為主。

   成像傳感器有兩個關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)：圖像分辨率與成像速度。更高的圖像分辨率能夠獲得更清晰的熒光成像圖。那么成像速度的重要性在哪里呢？

   葉綠素?zé)晒馐且环N比較特殊的熒光，由于它的強度與光合電子傳遞鏈的生理狀態(tài)密切相關(guān)，在測量過程中會快速而劇烈的變化，其強度的變化曲線被稱為葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線。從數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度上考慮，成像速度直接關(guān)系到CCD能夠靈敏捕捉到曲線的動態(tài)變化。因此，CCD成像速度的重要性還要高于圖像分辨率。

FluorCam葉綠素?zé)晒獯銣鐒恿W(xué)曲線的測量過程

   而這兩項技術(shù)參數(shù)是有一定的相互影響的。一般來說，圖像分辨率過大，必然會降低成像速度。因此在這兩者之間，需要取得一個平衡。有的CCD傳感器為了解決這一問題，采用了binning像素合并的數(shù)據(jù)處理方式，就是將一定數(shù)量（2的n次方）的像素點合并為一個像素點輸出數(shù)據(jù)，從而提高成像速度，但實際獲得成像圖的分辨率也要降低同樣的倍數(shù)。

binning像素合并的圖像輸出方式

   某品牌葉綠素?zé)晒獬上駜x器宣稱其圖像分辨率為1392×1040像素，成像速度為30幀/秒。但實際上1392×1040像素是在1×1 binning模式下，而30幀/秒則是在2×2 binning模式下。其在測量葉綠素?zé)晒鈺r為了確保成像速度，只能在2×2 binning模式下測量，最后得到的成像圖只有696×520（1392/2×1040/2）。FluorCam則可以在1360×1024的圖像分辨率下確保20幀/秒的成像速度。這是經(jīng)過反復(fù)測試后獲得的最佳平衡。

 3、實際成像圖

   有的老師可能發(fā)現(xiàn)，某些品牌的葉綠素?zé)晒獬上駜x器宣傳資料上的成像圖絢麗多彩、搖曳生姿。但其發(fā)表文獻中的成像圖卻是模模糊糊一大團，不要說像FluorCam這樣分辨出葉肉和葉脈，甚至連病斑、老葉幼葉都無法區(qū)分。從CCD和光源的技術(shù)參數(shù)上看起來沒有什么問題啊？這是什么原因？

FluorCam宣傳圖與文獻中的實際成像圖（赫爾辛基大學(xué)Wen，2019）

某荷蘭品牌葉綠素?zé)晒獬上駜x器的宣傳圖與某篇文獻中的實際成像圖

  我們先不考慮虛假宣傳的問題，只從技術(shù)的角度來分析一下這個問題的原因。

   目前的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)實際上是特指PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)。只是對葉綠素?zé)晒膺M行簡單地成像是沒有什么技術(shù)難度的。但是，只有通過PAM脈沖調(diào)制技術(shù)才能獲得真正準(zhǔn)確的熒光成像圖與對應(yīng)的數(shù)據(jù)。

   PAM，即Pulse Amplitude Modulation脈沖振幅調(diào)制或脈幅調(diào)制。PAM實際上是一種信號檢測方式。PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上駜x器在工作時，測量光按照一定的調(diào)制頻率，以閃爍的光脈沖形式照射植物樣品，成像CCD與測量光要進行嚴(yán)格地脈沖調(diào)制，即只記錄測量光激發(fā)的、與測量光同頻的熒光信號。

左圖：PAM信號檢測方式；右圖：FluorCam葉綠素?zé)晒獯銣鐒恿W(xué)曲線的PAM脈沖調(diào)制

葉綠素?zé)晒鉁y量應(yīng)用PAM技術(shù)的目的是：

• 調(diào)制后的測量光不會激發(fā)光反應(yīng)中心電荷分離，從而測量真實的F₀

• 能夠測量光適應(yīng)條件（開啟光化光）下的熒光，從而獲得完整的熒光淬滅動力學(xué)曲線，計算相關(guān)參數(shù)，如QY、NPQ、qP、Rfd、ETR等

   那么如果一臺葉綠素?zé)晒鈨x器不是真正的PAM脈沖調(diào)制技術(shù)會怎么樣呢？不但成像圖質(zhì)量大打折扣，同時由于最基本的最小熒光F₀（也稱為原初熒光，可以認(rèn)為是葉綠素?zé)晒獾谋镜字担o法測準(zhǔn)，后續(xù)所有基于F₀計算的熒光參數(shù)全部都不可靠。這樣的儀器就算是發(fā)表了文獻，經(jīng)常會出現(xiàn)完全超出葉綠素?zé)晒鈪?shù)理論范圍的結(jié)果。這樣的數(shù)據(jù)結(jié)果和成像圖又如何支持實驗研究的結(jié)論呢？

   所以說，不看廣告看療效。我們不能一味地相信廠家標(biāo)稱的技術(shù)參數(shù)，就如同我們買手機電腦不能單純看硬件配置，更要關(guān)注品牌型號一樣。而對于葉綠素?zé)晒獬上駜x器，*好的方法就是找一下相關(guān)的文獻，看一看實際的成像圖效果與對應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果。

3、軟件功能：葉綠素?zé)晒鈪?shù)及對應(yīng)成像圖、無人值守自動測量、

 1）PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈪?shù)

   基于不同的實驗?zāi)康模覀兛梢赃x擇不同的Protocol獲取熒光參數(shù)及對應(yīng)的成像圖：

• Fv/Fm：測量參數(shù)包括F₀，F(xiàn)m，F(xiàn)v，QYmax（Fv/Fm）等葉綠素?zé)晒鈪?shù)

• Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：F₀，F(xiàn)p，F(xiàn)v，F(xiàn)t_Lss，QY，Rfd等葉綠素?zé)晒鈪?shù)

• Quenching熒光淬滅動力學(xué)分析：F₀，F(xiàn)m，F(xiàn)p，F(xiàn)s，F(xiàn)v，F(xiàn)₀’，F(xiàn)m’，QYmax（Fv/Fm），QY，NPQ，qN，qP，Rfd，qL等50多個葉綠素?zé)晒鈪?shù)

• Light Curve光響應(yīng)曲線：不同光強梯度條件下Fo，F(xiàn)m，QY，QY_Ln，ETR等葉綠素?zé)晒鈪?shù)

   在熒光淬滅動力學(xué)測量時，還有一個難題，就是如何測量光適應(yīng)條件下的最小熒光F₀’。由于這光適應(yīng)條件下，難以讓測試樣品達到原初狀態(tài)，就沒辦法直接測量F₀’。這不是PAM技術(shù)本身可以解決的。因此，由于技術(shù)限制，很長一段時間內(nèi)葉綠素?zé)晒鈨x器都不能直接測量F₀’。1997年，Oxborough和Baker提出了一個F₀’的估算公式：

之后的一系列研究證明，這個公式估算得到的數(shù)據(jù)是可信的。但這個數(shù)據(jù)終究不是直接測量得到的。在很多研究尤其是光系統(tǒng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換研究中，這樣的數(shù)據(jù)是不能使用的。隨著技術(shù)的進步，F(xiàn)luorCam通過配備專用的遠紅光源板進行調(diào)制照射，使測量樣品達到原初狀態(tài)，從而實現(xiàn)對F₀’進行實測。從另外一個方面說，沒有配備遠紅光源或者是雖然有遠紅光，但不能對其進行調(diào)制測量的葉綠素?zé)晒鈨x或者熒光成像儀都是不能實際測量F₀’的。

 2）自定義編輯protocol與參數(shù)

   對于特定光合作用機制的深入研究，一般常用的測量Protocol可能就無法滿足需要了。比如中科院植物所光合作用研究中心、河南大學(xué)和瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)合作，研究擬南芥內(nèi)腔硫醇氧化還原酶LOT1與si氨酸/su氨酸蛋白激酶的功能性氧化還原鏈接。光合有機體為了應(yīng)對光強和光質(zhì)變化，需要進行狀態(tài)轉(zhuǎn)換來優(yōu)化光合產(chǎn)額并減輕光損傷。而這一過程與之密切相關(guān)。因此通過光合系統(tǒng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中葉綠素?zé)晒獾膭討B(tài)變化是研究這一過程的最佳方法。

左圖：狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程的熒光動力學(xué)曲線、熒光成像圖及熒光參數(shù)；右圖：由易科泰生態(tài)實驗室為本研究定制的protocol程序部分語句

   本研究通過FluorCam自定義編輯protocol功能，完美實現(xiàn)了光合狀態(tài)轉(zhuǎn)換的光照模擬與熒光動力學(xué)曲線檢測（上圖A、B），同時自動計算了狀態(tài)轉(zhuǎn)換參數(shù)qST（上圖D）并生成了相應(yīng)成像圖（上圖C），并與最大光化學(xué)效率Fv/Fm進行了對比（上圖F），為本次研究提供了極為重要的數(shù)據(jù)證明。

3）熒光成像圖模式

FluorCam軟件可提供不同的成像數(shù)據(jù)處理模式以供用戶獲得最符合實驗需求的彩色成像圖：

• 基于每個像素的數(shù)據(jù)生成成像圖：這種模式能夠非常直觀的顯示植物不同部位的熒光差異，是最常用的模式。如下左圖。

• 基于每個樣品的平均數(shù)據(jù)生成成像圖：這種模式下，每個樣品以其平均數(shù)據(jù)只顯示一種顏色，而不顯示其內(nèi)部差異。這種模式非常適用于大量樣品的快速篩選。如下中圖和下右圖。

左圖：病毒感染不同基因處理的擬南芥；中圖：利用細胞懸液進行敵草隆生物毒性快速檢測；右圖：番茄種苗活力快速定級

 FluorCam軟件還可以按不同的彩色標(biāo)尺生成不同顏色范圍的成像圖：

• 全光譜彩色標(biāo)尺：紅色-綠色-藍色-黑色的包含全部可見光色彩。這是對比度最好也是發(fā)表文獻最常用的標(biāo)尺。

• 多種內(nèi)置彩色標(biāo)尺：如紅藍、紅黃藍、白藍、白黑等不同標(biāo)尺，根據(jù)實際需要選配。如白黑灰度標(biāo)尺可以非常直觀地顯示發(fā)出熒光的部位。

• 自定義標(biāo)尺：軟件允許用戶自己設(shè)置不同的標(biāo)尺。比如綠黑標(biāo)尺，可以模擬顯示GFP綠色熒光的實際激發(fā)熒光圖。煙草GFP熒光成像圖的不tong彩色標(biāo)尺成像圖，左圖：全光譜彩色標(biāo)尺；中圖：GFP模擬標(biāo)尺；右圖：白黑灰度標(biāo)尺

4）無人值守自動測量

   在脅迫等實驗處理后，植物樣品會隨時間逐漸變化。如果用人工來測量這一動態(tài)變化過程的話，對人力損耗很大，時間上也難以精確。FluorCam提供無人值守自動測量功能則可以讓研究者很輕松地進行這一類實驗。

敵草隆吸收隨時間對葉片的損傷（Lichtenthaler，2013）

 5）圖像定量分級（閾值分割）

   植物樣品在實驗處理后，不同部位的受損程度不同。FluorCam軟件提供閾值分割的方法來將成像圖進行定量分級。比如將受脅迫的葉片按葉綠素?zé)晒鈪?shù)（如Fv/Fm）分為受損部位和健康部位，受損部位再進一步分為嚴(yán)重受損、中度受損和輕度受損。軟件可以輸出每種級別的成像圖、平均熒光數(shù)據(jù)和實際面積。大豆葉片感染病菌后的Fv/Fm葉綠素?zé)晒獬上駡D定量分級（Rousseau，2013）

4、擴展成像功能

   如果一臺葉綠素?zé)晒獬上駜x器還能進行其他成像測量，一臺儀器能當(dāng)多臺用，那不是大賺了嗎？那么讓我們看一下，以現(xiàn)在的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)而言，我們還能擴展哪些成像測量功能。

1）PAR吸收率成像

   我們都知道葉綠素?zé)晒鈪?shù)電子傳遞速率ETR=Φ_psII×PAR×0.5×leaf PAR absorptivity。一般的公式中會默認(rèn)植物光合有效輻射吸收率（PAR absorptivity）為0.84。但這僅僅是一個經(jīng)驗數(shù)據(jù)。對于不同植物、植物的不同部位、不同生理狀態(tài)和生長階段，其吸收率都是不同的。因此在實際應(yīng)用中，光合有效輻射吸收率應(yīng)該進行實測。光合有效輻射吸收率的實測是應(yīng)用了植物反射光譜的原理。植物對紅光是高吸收的，而對于近紅外光則是高反射的。因此，通過紅色光源與紅外光源照射植物樣品，測量植物樣品對每種光源的反射率，根據(jù)公式計算得出光合有效輻射吸收率。其計算公式為：

（Ulstrup，2007）

   FluorCam通過配備專用的紅色與紅外光源板、相應(yīng)的濾波輪和濾波片實現(xiàn)了對PAR吸收率以及NDVI植被歸一化指數(shù)的成像，不但使ETR的計算結(jié)果更加真實可信，而且PAR吸收率和NDVI的變化也可以直接反應(yīng)植物結(jié)構(gòu)生理和葉綠素含量的改變等。

左圖：植物在可見光和近紅外區(qū)的反射差異；右圖：FluorCam獲得的PAR吸收率成像圖

 2）GFP、YFP、RFP、DAPI等熒光蛋白或熒光染料成像

   在進行轉(zhuǎn)基因植物研究時，經(jīng)常需要用到GFP等各種熒光蛋白或熒光染料。以前在鑒定這些熒光蛋白表達時一般都是使用熒光顯微鏡對每一個樣品逐一篩查，工作量很大。FluorCam由于能夠配備多種不同波段的激發(fā)光源和相應(yīng)濾波片，具備了對熒光蛋白的高通量宏觀篩查的能力。同時由于其具備的熒光定量分析功能，還能對熒光蛋白的表達進行相對定量分析。

上圖：FluorCam 擬南芥GFP成像圖；下圖：FluorCam 玉米RFP成像圖；圖中發(fā)出明亮顏色的植株即為表達了熒光蛋白的部位，其顏色越偏向紅色，則表明其表達的熒光蛋白越多，可進行相對定量分析；黑色部位即為沒有表達熒光蛋白

 3）UV-MCF紫外激發(fā)多光譜熒光成像

   二十世紀(jì)八九十年代，植物生理學(xué)家和園藝學(xué)家對植物活體熒光——主要是葉綠素?zé)晒庋芯坎粩嗌钊?。?dāng)科學(xué)家使用UV紫外光對植物葉片進行激發(fā)，發(fā)現(xiàn)植物產(chǎn)生了具備4個特征性波峰的熒光光譜。這4個特征性波峰的波長分別為藍光440nm（F440）、綠光520nm（F520）、紅光690nm（F690）和遠紅外光740nm（F740）。這個特征激發(fā)熒光光譜就稱為多光譜熒光（Multi-color Fluorescence）。

左圖：煙草葉片上表面UV激發(fā)熒光光譜（Buschmann，1998）；中圖：多光譜熒光彩色光譜示意圖；右圖：不同顏色激發(fā)光的熒光激發(fā)特性（Benediktyová, 2009）

   進一步的研究發(fā)現(xiàn)，多光譜熒光與植物次生代謝總體水平、葉綠素濃度、脅迫早期指示等密切相關(guān)（Pineda, 2008），尤其在各種脅迫因素的早期識別與抗性評估中表現(xiàn)極為靈敏。

   在最近十年間，西班牙國家研究委員會（CSIC）已經(jīng)利用FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)結(jié)合FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)、熱成像技術(shù)，對多種蔬菜、水果的病害、養(yǎng)分、氣候變化適應(yīng)等開展了大量的研究。

西班牙國家研究委員會利用FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)等開展的相關(guān)研究：左圖：模擬溫室效應(yīng)下油菜的響應(yīng)與健康狀況；中圖：西葫蘆白粉病；右圖：甜瓜細菌性軟腐病

 4）雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上?/strong>

   如前文所說，PAM熒光淬滅動力學(xué)曲線、OJIP快速熒光動力學(xué)曲線和QA-再氧化動力學(xué)曲線分析是葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的三大主要測量技術(shù)路線，分別對應(yīng)光系統(tǒng)運行機理的不同方面。與PAM熒光淬滅分析主要針對光系統(tǒng)運行中較慢的光合穩(wěn)態(tài)與熒光淬滅不同，OJIP快速熒光動力學(xué)曲線和QA-再氧化動力學(xué)曲線分析都需要非常高的檢測速度。

   OJIP快速熒光動力學(xué)曲線測量要求對樣品經(jīng)過暗適應(yīng)后的最小熒光上升到最大熒光這一過程進行快速檢測。QA-再氧化動力學(xué)曲線測量是運用STF（single turnover flash，單周轉(zhuǎn)光閃）測量光系統(tǒng)II中QA再氧化過程中熒光產(chǎn)額的衰減曲線，從而衡量QA傳輸電子的能力。左圖：使用FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)獲得的大麥OJIP參數(shù)成像圖和動力學(xué)曲線（Jedmowski，2015）；中圖：使用FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)測量紫菜顯微QA-再氧化動力學(xué)成像圖；右圖：擬南芥的QA再氧化動力學(xué)曲線（Ding, 2016，中科院植物所）

   這兩種動力學(xué)分析在葉綠素?zé)晒鈨x上是相對比較容易實現(xiàn)的。FL6000雙調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x就可以同時實現(xiàn)這三類動力學(xué)分析。但由于成像CCD元件的成像速度限制，一般葉綠素?zé)晒獬上駜x器根本無法達到。國際上僅有FluorCam的兩個型號——FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)和FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)通過泵浦成像技術(shù)分別實現(xiàn)了葉片層次與細胞層次的OJIP和QA-再氧化動力學(xué)曲線的擬合成像測量并得到國際學(xué)界的認(rèn)可。

左圖：FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)；右圖：FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

   2019年，捷克科學(xué)院Küpper教授與PSI公司合作，shou次將超高靈敏度成像傳感器與葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了在640×512圖像分辨率下高達4000幀/秒的葉綠素?zé)晒獬上袼俣?。這一技術(shù)實現(xiàn)了真正的OJIP快速熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線和QA-再氧化動力學(xué)曲線成像測量

通過超高靈敏度FluorCam獲得的擬南芥和超積累植物Noccaea ochroleucum的OJIP快速熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線成像圖（左圖、中圖）與QA-再氧化動力學(xué)曲線（右圖）（Küpper，2019）

 5）FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像

   目前主要的葉綠素?zé)晒獬上駜x器都是針對宏觀樣品進行測量的。但很多研究中希望能夠?qū)蝹€微藻、大型藻或植物細胞乃至單個葉綠體直接進行葉綠素?zé)晒獬上駵y量，從細胞微觀尺度對光合作用進行研究。于是，將FluorCam熒光成像技術(shù)與生物熒光顯微成像技術(shù)有機結(jié)合的FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像技術(shù)便應(yīng)運而生。

FKM技術(shù)在藻類方面的一個突出研究成果是對藍藻異形胞的持續(xù)研究，弄清了異形胞分化過程中光合特性的變化以及與藍藻固氮的相互關(guān)系，乃至助力培育高固氮能力的藍藻新品種。

左：束毛藻葉綠素?zé)晒馀c固氮酶的分布關(guān)系（Berman-Frank，2001）；中：魚腥藻異形胞PSII反應(yīng)中心變化（Ferimazova，2013）；右：異形胞藻膽素?zé)晒鈐i高的藍藻新品種Anabaena 33047 ΔnblA（Bandyopadhyay，2021）

   在高等植物方面，F(xiàn)KM技術(shù)則廣泛應(yīng)用于各種特殊的微觀光合結(jié)構(gòu)的功能研究，如秋海棠藍色葉片中的特殊質(zhì)體、玉米葉片“花環(huán)”結(jié)構(gòu)等。左圖：秋海棠藍色葉片中的特殊質(zhì)體iridoplasts與葉肉細胞葉綠體的光合能力差異（Jacobs，2016）；右圖：干旱脅迫下玉米葉肉細胞葉綠體和維管束鞘葉綠體的光合能力差異（劉文娟，2020）

三、FluorCam 1300植物葉綠素?zé)晒馀c多光譜熒光成像系統(tǒng)

   時至今日，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)依然在不斷更新升級。最后，我們簡單介紹一下FluorCam系列的新技術(shù)成果。

   FluorCam 1300植物葉綠素?zé)晒馀c多光譜熒光成像系統(tǒng)是FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的最新升級產(chǎn)品。無需更換配件即可實現(xiàn)PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒狻V-MCF紫外激發(fā)多光譜熒光和GFP、RFP、YFP等熒光蛋白和熒光染料的成像分析。測量對象包括葉片、果實、花朵、麥穗、整株小型植株、苔蘚、微藻、大型藻類乃至特定的動物樣品。功能特點：

• FluorCam 1300同時具備葉綠素?zé)晒饧ぐl(fā)光源組、多光譜熒光激發(fā)光源組和熒光濾波器組，無需更換任何配件即可同步實現(xiàn)多激發(fā)光-多光譜熒光成像功能：

  • PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上?/span>

  • 紫外激發(fā)F440、F520、F690、F740多光譜熒光成像

  • GFP、RFP、YFP等常用熒光蛋白成像

• 一體式設(shè)計，自帶暗適應(yīng)箱體

• 最佳成像面積：20×20cm

• 葉綠素?zé)晒饧ぐl(fā)光源組：

  • 測量光：620nm紅光

  • 光化學(xué)光：620nm紅光、5700K冷白光，最大光強1500µmol(photons)/m².s

  • 飽和脈沖光：5700K冷白光，最大光強5000µmol(photons)/m².s

  • 735nm遠紅光，用于測量光適應(yīng)條件下的最小熒光F₀’

• 多光譜熒光激發(fā)光源組（選配）：6色集成光源，每個光源同時具備6種不同波長的光發(fā)射能力，包括365nm紫外光，445nm品藍光，470nm藍光，505nm青光，530nm綠光，590nm琥珀色光實測成像圖：不同顏色凌霄葉片的熒光成像分析

左圖：不同顏色凌霄葉片的RGB圖；右圖：葉綠素?zé)晒獬上駡D

多光譜熒光成像圖：F440與F520為次生代謝熒光成像圖；F740/F690與葉綠素濃度及分布相關(guān)