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蛋白質分子量的測定（SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳法）

時間：2011-12-26閱讀：1541
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一、原理
用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離鑒定蛋白質（protein），主要依賴于電荷效應和分子篩效應。再與標準樣品對照即可確定各區帶的成分。要利用凝膠電泳測定某樣品的蛋白質分子量就必須去掉其電荷效應，使樣品的蛋白質分子的遷移率*取決于分子量。如在電泳體系中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate簡稱SDS）。這種陰離子表面活性劑濃度大于1mmol/L時，以1．4gSDS與1g蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷，這種負電荷遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷差別，從而降低或消除了各種蛋白質天然電荷差別。巰基乙醇是蛋白質分子中二硫鍵的還原劑，使多肽組分分成單個亞單位。SDS可打斷蛋白質的氫鍵。因此它與蛋白質結合后，還引起蛋白質構象的改變，此復合物的流體力學和光學性質均表明，它們在水溶液中的形狀近似長橢園的棒狀。不同蛋白質-SDS復合物的短軸相同，約1．8nm，而長軸改變與蛋白質的分子量成正比。所以，各種SDS-蛋白質復合物在電泳中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是按照分子的大小由凝膠的分子篩效應進行分離，其有效遷移率與分子量的對數成線性關系。這樣就可以根據標準蛋白質分子量的對數和遷移率所作的標準曲線得出末知樣品蛋白質的分子量。

二、材料、儀器設備及試劑：
（一）材料：小麥芽
（二）儀器設備：1.垂直板電泳槽及附件；2.直流穩壓穩流電泳儀；3.微量進樣器；4.其它常用用具。
（三）試劑：1. 下層膠緩沖液：18.17gTris，0.4gSDS，溶于水.用1mol/L HCl調pH8.8，定容至100ml。2. 上層膠緩沖液：6.06gTris，0.4gSDS，溶于水，用1mol/L HCl調pH至6.8，定容100ml。3. Acr／Bis貯備液：30gAcr，0.8gBis，溶解后定容至100ml。4. 10％過硫酸銨，用時現配。5. 樣品緩沖液：Tris0.6g，甘油5ml，SDS1g溶于水，用HCl調pH至8.0，再加溴酚藍0.1g，巰基乙醇2.5ml，定容至100ml。 6. 電極緩沖液：Tris3.03g，Gly14.14g，SDS1.0g，溶于水，用HCL調pH至8.3容至1000ml。7. 染色液的配制：45％甲醇，0.25％考馬斯亮藍R－250。8. 脫色液：2.5％甲醇，10％醋酸。9. 1.5％瓊脂：1.5g瓊脂溶于100ml電極緩沖液中，加熱溶解。10. 標準分子量蛋白質

三、實驗步驟：
1. 電泳槽的安裝：干燥的兩塊玻璃板裝入配套塑料夾套內，垂直固定在電泳槽上，周邊用1.5％的瓊脂密封。
2. 樣品處理：將各種標準蛋白質和待測樣品分別溶于蛋白質處理液（濃度2mg/ml），在沸水中加熱3～4min，待冷卻后作點樣用。
3. 制膠：選擇合適的膠濃度按下表配制7.5％的分離膠，混合后將其沿長玻璃板加入兩塊玻璃板之間（小心不要產生氣泡），加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即復蓋2～3mm水層，靜止聚合約40min左右。膠聚合好的標志是膠與水之間形成清晰的界面。吸取分離膠的水分，將配制好的濃縮膠注入分離膠之上，立即插上有機玻璃的點樣槽模板，待濃縮膠聚合好備用。
4. 點樣：用微量注射器分別吸取標準蛋白質樣品液5μl，按分子量（從小到大）的順序注入樣品槽內的濃縮膠面上，同時吸取待測樣品液25μl，注入其它樣品槽內，在樣品上小心地注入電極緩沖液。
5. 電泳：加樣完畢，兩槽注入電極緩沖液，接通電源（上負下正），調節電流為15mA，當指示劑進入分離膠后，電流需加大到30mA，電壓恒定在80～100伏之間，約3～4h后，指示劑達到距前沿1～2cm時，可終止電泳。
6. 固定：膠取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后將膠浸泡在25％異丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白質就得到固定了。
7. 染色：取出凝膠板，測定膠長（D1）后，加入染色液染色2h。
8. 脫色：將膠放在脫色液中脫色0.5h，每隔0.5h換一次脫色液，至少換3次，待藍色基本脫掉，再放在脫色液里浸泡至蛋白質譜帶清晰為止，測定膠長（D2）。

四、蛋白質標準樣品遷移率和待測樣品分子量的計算
根據蛋白質分子量對數和電泳遷移率的關系，測量溴酚藍和各種蛋白質遷移距離。把溴酚藍遷移的距離定為d1，蛋白質遷移距離定為d2，并以D1定為凝膠染色前的長度，D2定為凝膠染色后的長度。根據下面公式計算各種蛋白質的遷移率Rm：Rm＝d2d1×D1D2以標準蛋白質的遷移率為橫座標，以其對應的分子量對數為縱座標，繪制標準曲線，可得到一條直線，然后根據未知樣品的遷移率，在半對數座標圖上查出其對應的分子量。要得到一個可靠的結果，實驗需多次重復。
 

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