1、 菌株

用GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達(dá)。

2、溫度：
　在28度和室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)水平可能都不低。

3、pH

手冊(cè)上用6.0，pH提高到6.8，不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國內(nèi)外做的的rHSA，zui適pH大概5-6左右。pH3的時(shí)候yeast和peptone好像會(huì)沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào)，具體比例自己去試試。

4、偏愛密碼子

codon bias一般不是主要的問題，你要表達(dá)的蛋白特性才是主要問題，酵母對(duì)分子量大(30KD以上)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜(如一些蛋白酶)，二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達(dá)，尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對(duì)一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白表達(dá)量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pichia酵母表達(dá)一個(gè)單鏈抗體，29KD，含有2對(duì)二硫鍵，表達(dá)量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達(dá)量沒有什么提高。

5、表達(dá)時(shí)間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照

誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)了以后，是會(huì)有很多蛋白分泌出來的，時(shí)間越長(zhǎng)雜蛋白就越多，且分子量都比較大。做一個(gè)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)照，這樣就會(huì)比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。

6、污染

每個(gè)樣品從G418板上挑10個(gè)左右單克隆于2ml BMGY搖菌(30ml玻璃管，比LB管大一點(diǎn))，紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml換2ml BMMY誘導(dǎo)表達(dá)，3,4層紗布足夠了。

污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的，只蓋紗布肯定會(huì)污染。加蓋報(bào)紙后，就再?zèng)]遇到過污染。如果只用6層紗布，污染的可能當(dāng)然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報(bào)紙拴緊封口，空氣浴搖床。

7、不表達(dá)

蛋白有沒有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了，一般重復(fù)2－3次實(shí)驗(yàn)都沒有表達(dá)菌株，這個(gè)蛋白就放棄表達(dá)了。

8、表達(dá)量

30KD,10mg/L表達(dá)量已經(jīng)很高，zui直接的方法是發(fā)酵，一般提高5－10倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表達(dá)的N糖基化是可以預(yù)測(cè)的，有如下序列：N X S/T就是潛在的糖基化位點(diǎn)，X為任意氨基酸，1個(gè)糖基化位點(diǎn)會(huì)加上1－3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無法預(yù)測(cè)其位點(diǎn)，不過很少聽說表達(dá)蛋白有O糖基化的。如果胞內(nèi)表達(dá)，不存在糖基化的問題。

10、表型與表達(dá)

重組SalI和BglII酶切產(chǎn)生單交換和雙交換，結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)生長(zhǎng)快，消耗的甲醇多，后者生長(zhǎng)慢，消耗的甲醇少，所以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對(duì)某些蛋白Muts菌株可能表達(dá)的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá)較好。

11、培養(yǎng)基

YPD：zui基本的培養(yǎng)用；BMGY：誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用；BMMY：誘導(dǎo)表達(dá)用；MD：電轉(zhuǎn)化后篩選his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因?yàn)橛衅咸烟牵@樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會(huì)抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時(shí)也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%甲醇至你要的濃度。

YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養(yǎng)基高壓滅菌后加入；配YPD時(shí)可以加入YPD一起滅菌，但時(shí)間不能太長(zhǎng)，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時(shí)間過長(zhǎng)，溫度過高，可能導(dǎo)致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養(yǎng)基108度35min高壓滅菌。

小量發(fā)酵其實(shí)可以把培養(yǎng)基成分中的YNB和生物素去除，培養(yǎng)基價(jià)格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。

如果是用自己配置的培養(yǎng)基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)需要。
用無機(jī)鹽進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，更省錢。

大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個(gè)鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個(gè)批次100h左右估計(jì)3－4瓶氧氣。

關(guān)于Tryptone和Peptone的選擇：

1)用培養(yǎng)E.coli的Tryptone替代Peptone對(duì)有些酵母菌可以,例如一般的表達(dá)酵母.但是對(duì)有酵母菌些不行.例如做雙雜交的AH109,Y187之類表達(dá)酵母，根本就長(zhǎng)不好．

2)Tryptone和Peptone雖然都是營養(yǎng)胨，但營養(yǎng)成分不一樣．即使是一般的表達(dá)酵母可以在Tryptone生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)也沒有在Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有點(diǎn)不同外，其他沒什么區(qū)別，用peptone的目的不是為了提供氮源，提供氮源的是培養(yǎng)基里面的YNB。

3)如果要求不高，一般使用也還湊合．盡可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國產(chǎn)的蛋白胨都可以很正常的培養(yǎng)絕大多數(shù)酵母菌．

4)用含Peptone的培養(yǎng)基顏色很深，純化表達(dá)蛋白時(shí)顏色要去掉，所以還要進(jìn)行麻煩的后續(xù)處理。而改用Tryptone后，培養(yǎng)基顏色變得很淺，和LB(液體)顏色差不多，后續(xù)處理要簡(jiǎn)單些。invitrogen說明書說 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競(jìng)爭(zhēng)性抑制目的蛋白的水解，因?yàn)閜eptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。

培養(yǎng)畢赤酵母,書上說BIOTIN儲(chǔ)液是水溶液,但事實(shí)上BIOTIN很難溶于水, 可以稍稍水浴加熱一下。配制500×BIOTIN stock solution(0.02％)有這么3種方案：
1)、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；
2)、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3)、水浴加熱，溫度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。MD、MM屬于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，沒有哪種成分會(huì)含有微量生長(zhǎng)因子(如生物素)。所以肯定要加的。

附：無機(jī)培養(yǎng)基配方

BSM無機(jī)培養(yǎng)基：

85% H3PO4 26.7ml/L

CaSO4 ·2H2O 0.93g/L

K2SO4 18.2g/L

MgSO4·2H2O 14.9g/L

KOH 4.13g/L

甘油 40g/L

PMT1 4.0ml/L

100%氨水調(diào)pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫 酸銨調(diào)pH5.0，氨水用于上罐調(diào)pH(便宜，方便)。誘導(dǎo)表達(dá)前調(diào)pH6.0。pH5.0是為了防止BSM形成磷酸鈣沉淀，pH6.0是表達(dá)HSA融合蛋白的zui適pH。

BSM高壓滅菌后再加4.0ml/L 過濾除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的融合蛋白。

PMT1(1L)配方：

CuSO4·5H2O 6.0g/L

KI 0.088g/L

MnSO4·H2O 3.0g/L

Na2MoO4·2H2O 0.2g/L

H3BO3 0.02g/L

CoCl2·6H2O 0.5g/L

ZnCl2 20.0g/L

FeSO4·7H2O 65.0g/L

Biotin 0.2g/L

濃H2SO4 5.0ml

12、蛋白降解

分泌表達(dá)的目標(biāo)蛋白比胞內(nèi)蛋白確實(shí)容易被降解。可以嘗試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養(yǎng)液的pH值減少酶活，酵母生長(zhǎng)pH值比較廣，4～7都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當(dāng)酶解底物(比如酵母酸)；3、摸索zui適下罐(搖瓶也一樣)，寧可少表達(dá)點(diǎn)也別給降解光了。實(shí)在沒辦法，只好換菌株或做pcr突變酶切位點(diǎn)(當(dāng)然不能影響表達(dá)和蛋白活性)。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.
1)、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases.
2)、The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3)、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequay, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

連續(xù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的堿性氨基酸相鄰的結(jié)構(gòu)，如果有的話，在這一位點(diǎn)是很容易被蛋白酶切斷，產(chǎn)生偏小的多肽。

13、換液

通常用BMGY和BMMY是要換液的，但也可以不用換液。培養(yǎng)到菌液渾濁后，直接向BMGY里加甲醇誘導(dǎo)就行了。GS115在第4天達(dá)到了zui高表達(dá)量。換液不是必要的，適量甘油的存在有時(shí)反而會(huì)使表達(dá)量提高，

10ml生長(zhǎng)培養(yǎng)后，等體積換液。我用250三角瓶，裝量25mlBMGY發(fā)酵2天，再取0.5ml加入BMMY(250三角瓶，裝量25ml)中誘導(dǎo)發(fā)酵.

BMGY和BMMY的換液方式有2種：
1)一種是離心換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到滅菌大離心管中，4000rpm室溫離心5分鐘后，用BMMY洗下菌體，再轉(zhuǎn)移到搖瓶，整個(gè)過程均用滅菌移液管操作。另外2)一種是靜止換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，將搖瓶在無菌室靜止4小時(shí)后，直接在酒精燈旁傾倒培養(yǎng)液，再加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此種方法的缺點(diǎn)有少量生長(zhǎng)培養(yǎng)基殘留。
是離心換液或者靜止換液，到底那個(gè)好，只有根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來考量。如果只是從防治污染的角度來說，靜止換液也好一些，因?yàn)椴僮鳟吘股僖恍俣纫部臁?/p>

總之，無論是取樣還是補(bǔ)料、加甲醇，盡量用滅菌的移液管(因?yàn)楸容^長(zhǎng)，不容易引起污染)。當(dāng)然，微量的如200ul，還是用移液器加(快而準(zhǔn)確)，可以在瓶口處往瓶?jī)?nèi)加入100％甲醇等。用新開啟的分析純甲醇，我們都沒有過濾或者其他處理，一直放在無菌室里面，每次直接用滅菌TIP吸取加入搖瓶就可以了。實(shí)驗(yàn)室里也有人試過用膜過濾，結(jié)果膜都溶解了。

14、上罐表達(dá)

放罐時(shí)OD能達(dá)到400左右，生長(zhǎng)過程zui高OD500左右，重組蛋白發(fā)酵水平大約300-400mg/L。30g/L甘油初始培養(yǎng)OD約40左右，流加約420g/L甘油后，菌體密度達(dá)到zui高約500。開始誘導(dǎo)后，起初3－5h之內(nèi)流加的甲醇很少，發(fā)酵體積變化小，但是菌體的OD值是快速下降的，一般是原來的90%左右，每次都是這樣，確切原因我們也還不清楚，估計(jì)是酵母從高速生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向營養(yǎng)饑餓過程中，菌體形態(tài)發(fā)生很大變化，比如大小、含水量、折光率等。隨酵母逐漸適應(yīng)利用甲醇為碳源，mut＋型酵母的誘導(dǎo)可以將甲醇的流速逐步提高，此時(shí)仍然能發(fā)現(xiàn)OD值下降，我們認(rèn)為這主要是發(fā)酵體積增加的原因造成的。我們誘導(dǎo)過程一般增加約40%的體積7L到10L，zui終OD值約為zui高OD值的80%左右，簡(jiǎn)單換算一下，應(yīng)該知道菌體生物量增加約1/7。其實(shí)，這和畢赤酵母代謝甲醇途徑也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分繼續(xù)氧化成甲酸進(jìn)而生成CO2，產(chǎn)生菌體所需的能量，另一部分可以被菌體同化，進(jìn)入小分子碳架的合成途徑，提供菌體生長(zhǎng)所需的碳源。

15、菌體密度：

菌體是在BMMY中培養(yǎng)的，可以不用BMMY做對(duì)照，在600nm處測(cè)OD值，培養(yǎng)基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。

麥芽浸提液培養(yǎng)酵母(不換液，補(bǔ)料)，生長(zhǎng)階段結(jié)束后，密度可達(dá)到10-12，誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，密度可達(dá)到18左右。
如果用1體積的BMGY，在生長(zhǎng)階段結(jié)束后，換液時(shí)，加入1/10——1/2體積的BMMY進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)(即濃縮培養(yǎng))，細(xì)胞密度也可達(dá)到20以上。
通常，真正的高密度發(fā)酵只有在發(fā)酵罐里才能實(shí)現(xiàn)，OD600可達(dá)到40-60及以上。搖瓶很難達(dá)到那樣的密度，不過可以采取濃縮培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)高密度。
搖瓶不能像發(fā)酵罐那樣保證通氣量，但可以通過裝量來暫時(shí)替代這個(gè)指標(biāo)。

17、菌種保存

用15%甘油做保護(hù)劑，-70度長(zhǎng)期保存，-20度短期保存使用。不過要注意凍存前一定充分混勻，酵母菌體很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。

一般OD2-6的YPD過夜菌吸取300ul菌液到滅菌的ＥＰ管然后加等體積的甘油，混勻，放于－２０度．保存長(zhǎng)的話放－８０度冰箱。

重組菌株傳代次數(shù)太多，確實(shí)可能存在菌株退化的現(xiàn)象。這在用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如CHO，NS0系統(tǒng)更為明顯，所以一定要保存好zui原始的重組菌株，每次從中劃板，挑單克隆表達(dá)，盡量減少菌株傳代次數(shù)。不行的話再用相同的方法重新轉(zhuǎn)化篩選高表達(dá)菌株。

GS115的鑒定方法

接種GS115于5ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養(yǎng)48 小時(shí)，用 YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長(zhǎng)而在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的單菌落劃YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突變了，不能在組胺酸缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，一般的YPD培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，什么都有了，而YNB卻只含基本氮源，GS115應(yīng)該在上面不長(zhǎng)，就是從YPD上挑菌落，在YNB和補(bǔ)充了HIS的平板上對(duì)應(yīng)的點(diǎn)一下，在HIS上長(zhǎng)而YNB上不長(zhǎng)的是GS115，這樣能挑到純的，以防突變。
附：TCA沉淀方法；ELISA protocol；原位雙膜法快速檢測(cè)陽性表達(dá)株：

TCA沉淀方法

培養(yǎng)基上清直接電泳跑出來的條帶經(jīng)常很難看，可以TCA沉淀濃縮后跑電泳，。表達(dá)上清很少有直接考染能看得到條帶的， 1ml表達(dá)上清濃縮到20ul直接電泳。一般表達(dá)量大于1mg/ml可以看到明顯條帶，但重復(fù)性不好。

具體步驟：

1.菌液10000g,離心5分鐘，收集表達(dá)上清。

2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9體積的100％TCA，顛倒10次混勻。

3.樣品置于冰浴中大于0.5小時(shí)，過夜效果更好。

4.15000g,離心10－20分鐘,可見有棕黑色沉淀，倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。

5.將EP管倒置于吸水紙長(zhǎng)，37度烘箱10－20分鐘，待管底無明顯液體殘留，如果管壁還殘留有液體，可以吸水紙吸掉。可以改成室溫或用電吹風(fēng)，關(guān)鍵是除去管底和管壁殘余液體。

6.15000g,離心10－20分鐘,用20ul槍頭盡量吸去管底殘余的液體，此步驟要快，不然沉淀容易散開，降低蛋白回收率，一般zui多幾u(yù)l或者沒有，注意不要吸到沉淀。

7.EP管倒置于吸水紙長(zhǎng)，37度烘箱5分鐘，確認(rèn)管壁和管底沒有液體殘留。

8.加入20－50ul Loading buffer，95度加熱10nim，一般沉淀會(huì)自動(dòng)溶解，如果不溶，用手指輕彈管壁或用20ul槍頭輕輕吸打，注意整個(gè)操作盡量不要碰到管壁，因?yàn)楣鼙诳赡苷从袣堄郥CA。如果藍(lán)色的Loading buffer不變成，說明殘余TCA吸棄了干凈，如果變黃，一般不影響電泳。此方法連丙酮洗這一步都省了，而且不影響電泳效果。

或者第5步和第6步改為丙酮洗:

5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指輕彈EP管，洗去管底和管壁殘余的TCA。

6.15000g,離心10－20分鐘,倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。

樣品是酵母細(xì)胞超聲后離心獲得的上清，用Loading buffer溶解蛋白沉淀，始終不能溶解，而且加熱超過10分鐘以后也依舊不溶解。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，顏色是綠的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的，比較少，一般用丙酮洗一步后很好溶。沉淀不溶，很可能是TCA沒有除干凈)

ELISA protocol：

用BMMY培養(yǎng)基一般表達(dá)1－2天收集表達(dá)上清，稀釋一定比例鋪板做ELISA檢測(cè)

1.取5－10ul BMMY表達(dá)上清用0.05M NaHCO3稀釋到100ul鋪ELISA板，37度或室溫振蕩大于1小時(shí)。注意一定要做一個(gè)GS115空菌株表達(dá)上清作為陰性對(duì)照，還找一個(gè)帶有histag的蛋白作為陽性對(duì)照。

2.TPBS洗板3次，方法：倒掉鋪板液，倒置于毛巾上輕輕拍打幾次，加TPBS至滿，重復(fù)。

3.加封閉液(TPBS加1％脫脂奶粉)350ml/孔，室溫下放置40分鐘－1小時(shí)，TPBS洗3次。

4.加封閉液稀釋的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.5－1小時(shí)，TPBS洗3次。很多公司都有histag的單抗，個(gè)人覺得Qiagen和Pharmacia單抗較好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀釋，不同公司的抗體效價(jià)不同。

5.加封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.5－1小時(shí)，TPBS洗3次。二抗很多公司有，國產(chǎn)的華美都可以，1：500－1000。如果是HRP標(biāo)記的histag抗體，不加二抗直接顯色。

6.加入OPD顯色液100ul/孔，避光反應(yīng)約10－30分鐘。顯色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 檸檬酸鈉，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB顯色。

7.1M H2SO4 100ul/孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)OD490nm。

TCA沉淀考染看不到條帶，可以打算作ELISA，但可能上清里面雜蛋白太多，抗原(目的蛋白)不可能包被到板子上，所以幾乎不可能檢測(cè)到的。他們建議作點(diǎn)雜交，就是把少許上清點(diǎn)到PVDF膜上，以后就按照western blot 就可以了。ELISA使用多抗，意義不是很大，因?yàn)榇_實(shí)陰性對(duì)照也顯色，和陽性結(jié)果差不了太多，特別是蛋白表達(dá)水平不高的話，兩者區(qū)別很不明顯，一抗是自己制備的多抗,空白值在0.2左右,陰性對(duì)照(即空白宿主自身表達(dá)的上清)OD值大約在0.35-0.4之間,目的蛋白測(cè)的值卻在0.6-0.65.可見效果還是比較明顯的.因?yàn)槭嵌嗫龟幮詫?duì)照難免會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響.沒有單抗也只能這樣了.

原位雙膜法快速檢測(cè)陽性表達(dá)株：

1) 將醋酸纖維素薄膜置于MD/His -平板的His + 轉(zhuǎn)化子菌落上,用涂布棒輕壓使醋酸纖維素薄膜*濕潤并趕盡氣泡, 使所有菌落轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上.

2) 在BMMY板上置一同樣大小的硝 酸纖維素薄膜, 并將醋酸纖維素薄膜菌落向上置于硝 酸纖維素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 將醋酸纖維素薄膜移至MDP2His 平板上, 4 ℃保存

3) 將硝 酸纖維素薄膜取下, 6 %小牛血清37 ℃封閉2 h , TBS-T ( Tris-NaCl 緩沖液加0105 %吐溫20) 洗3 次( 每次10 min) . 加一抗室溫孵育2 h , TBS－T 洗膜3 次. 然后二抗室溫孵育2 h , TBS2T 洗膜3 次. zui后顯色。

在強(qiáng)弱不等的顏色中挑選染色zui強(qiáng)的克隆，做誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證。操作時(shí)，一定要記好位置，以免不能將膜上的克隆和板上的克隆對(duì)上。

纖維素膜的選擇根據(jù)？都用醋酸膜行嗎？

以后的步驟就基本上是做western，所以用硝 酸纖維素膜通過虹吸將醋酸纖維素膜上的菌落分泌的液體轉(zhuǎn)到硝 酸膜上，相當(dāng)于western的轉(zhuǎn)膜過程。