根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，ELISA試劑盒即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)，ELISA試劑盒類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，ELISA試劑盒而不再形成夾心復(fù)合物，ELISA試劑盒所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

（一）雙抗體夾心法

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

（2）加受檢標(biāo)本：ELISA試劑盒使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，ELISA試劑盒形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

（3）加酶標(biāo)抗體：ELISA試劑盒使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。ELISA試劑盒*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。ELISA試劑盒根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

（二）雙位點(diǎn)一步法

      在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，ELISA試劑盒如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步（圖15-5）。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，ELISA試劑盒測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。