大腸埃希菌的生物危害評估報告

一、大腸埃希菌的傳播與致病

埃希菌屬包括多種細菌，臨床上以大腸埃希菌zui為常見。大腸埃希菌（E.coli）通稱大腸桿菌，是所有哺乳動物大腸中的正常寄生菌，一方面能合成維生素B及K供機體吸收利用。另一方面能抑制腐敗菌及病原菌和真菌的過度增殖。但當(dāng)它們離開腸道的寄生部位，進入到機體其他部位時，能引起感染發(fā)病。有些菌型有致病性，引起腸道或尿路感染性疾患。

大腸埃希菌所引起的食源性疾病主要由動物性食品引起，常見中毒食品為：各類熟肉制品、蛋及蛋制品、生牛奶及奶制品、漢堡包、乳酪，其次為蔬菜、水果、鮮榨果汁、飲料等。中毒原因主要是食品未經(jīng)*加熱，或加工過程中造成的交叉污染，老人及嬰幼兒為易感人群。

大腸埃希菌可以引起腸道外感染如泌尿系感染、菌血癥、膽囊炎、肺炎及新生兒腦膜炎等，也會造成從輕微腹瀉到霍亂樣嚴重腹瀉乃至引起致死性的并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征（HUS），根據(jù)其不同的血清型別、毒力和所致臨床癥狀的不同，可以將導(dǎo)致腹瀉的大腸埃希菌分為5類：（1）產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（enterotoxigenic             E.coli,ETEC）：是許多發(fā)展中國家兒童及旅游者腹瀉常見病原菌，熱帶尤為常見。由食入污染食物和水而致病。本菌可產(chǎn)生大量耐熱和非耐熱腸毒素，患者腹瀉呈水樣便，伴有惡心、腹痛、發(fā)熱等癥。（2）腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic E.coli,EPEC）：可引起嬰兒腸炎，夏季腹瀉及嬰兒霍亂。本菌具有很強傳染性，可引起院內(nèi)暴發(fā)流行，也可引起成人腹瀉。傳染源來自食品操作人員或糞便污染供水設(shè)施。（3）腸侵襲性大腸桿菌（enteroinvasive E.coli,EIEC）：由人－人傳染而致病（推測為糞－口途徑）。因具有侵襲性，侵入人體腸粘膜上皮細胞后可迅速繁殖，破壞腸粘膜及其基底膜，出現(xiàn)粘膜潰瘍，發(fā)病多呈散在性。與痢疾桿菌相似，引起痢疾樣腹瀉。（4）腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic E.coli,EHEC）：可引起暴發(fā)或散在性出血性結(jié)腸炎。患者常出現(xiàn)中度高熱、惡心、嘔吐，痙攣性腹痛、腹瀉，早期為水樣便，患者出現(xiàn)貧血、血小板減少，少數(shù)出現(xiàn)急性腎功能衰竭，溶血性尿毒綜合征。（5）腸粘附性大腸桿菌（enteroadherent E.coli,EAEC）：是兒童持續(xù)性腹瀉的病因之一。

二、大腸埃希菌的生物學(xué)特性

埃希菌屬屬于腸桿菌科

1、形態(tài)染色：為革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，周身有菌毛。

2、培養(yǎng)特性 需氧或兼性厭氧。在普通培養(yǎng)基上生長良好，形成中等大小的光滑型菌落；在鑒別培養(yǎng)基上因分解乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變色，菌落被著色；在SS、中國藍及伊紅美藍平板上分別呈紅色、藍色及紫黑色，借此可與沙門菌及志賀菌相鑒別，但應(yīng)注意少數(shù)菌株分解乳糖緩慢。

3、生化反應(yīng)：本菌生化反應(yīng)活潑，能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等多種糖類，（即IMViC反應(yīng)++--）。

4、膽鹽、煌綠染料等對大腸桿菌有明顯的抑菌作用。

5、抗原構(gòu)造：大腸桿菌的抗原構(gòu)造較為復(fù)雜，主要有（1）菌體抗原（O抗原），為細菌細胞壁的成分，化學(xué)成分屬脂多糖，脂多糖的重復(fù)寡糖單位在核心多糖外側(cè)，是脂多糖分子的zui外層，決定O抗原的特異性。O抗原耐熱，加熱100℃不能滅活，目前已知O抗原有171種，是血清學(xué)分型的基礎(chǔ)。（2）鞭毛抗原（H抗原），成分為鞭毛蛋白，不耐熱，已知有56種，均為單相菌株。（3）莢膜或包膜（K）抗原，成分以多糖類為主，對熱穩(wěn)定。K抗原的存在時能阻止O凝集，已知有100種，但不是每個菌株都有K抗原。大腸埃希菌的血清型按O：K：H的順序，以數(shù)字表示，如腸出血性大腸桿菌的血清型O157:H7。

6、致病因子：除內(nèi)毒素、莢膜腸桿菌科共有的毒力因子外，大腸埃希菌具有*的毒力因子有：黏附素——具有高度特異性，引起吸附-定植-致病；外毒素（由ETEC產(chǎn)生的腸毒素），包括（1）不耐熱腸毒素（LT），分LT-I和LT-Ⅱ兩型，本質(zhì)為蛋白質(zhì)，對熱不穩(wěn)定，與霍亂腸毒素相似；2）耐熱腸毒素（ST），分STa、STb兩型，為低分子多肽，對熱穩(wěn)定，致病機制為激活細胞鳥苷酸環(huán)化酶，使cGMP↑導(dǎo)致腹瀉，當(dāng)LT和ST同時存在，致病性更強。

三、大腸埃希菌的實驗室檢查及診斷

1、樣本采集  采集來自臨床的各種標本，如血液、尿液、體液、膿汁、痰和分泌物等

2、分離培養(yǎng)  將血液標本接種于肉湯，生長后再移種于血瓊脂平板上，膿汁、痰和分泌物標本與體液（取離心后的沉淀物）標本直接接種于血平板上。尿液標本應(yīng)同時做菌落計數(shù)。于36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落。

3、鑒定培養(yǎng)  可將菌液進一步接種于乳糖膽鹽培養(yǎng)基或麥康凱、伊紅美藍瓊脂平板于36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。　

4、生化試驗

（1）自（鑒定）平板上直接挑取數(shù)個菌落分別接種三糖鐵瓊脂（TSI）或克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）。同時將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、pH7.2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36℃培養(yǎng)過夜。

（2）結(jié)果：在TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸埃希氏菌。必要時做氧化酶試驗和革蘭氏染色。

5、血清學(xué)試驗

（1）假定試驗：挑取經(jīng)生化試驗證實為大腸埃希氏菌的瓊脂培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌和產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌多價O血清和出血性大腸埃希氏菌O157血清做玻片凝集試驗。當(dāng)與某一種多價O血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。如與某一個單價O血清呈現(xiàn)強凝集反應(yīng)，即為假定試驗陽性。

（2）證實試驗：制備O抗原懸液，稀釋至與Mac Farland3號比濁管相當(dāng)?shù)臐舛取Ｔr為1：160～1：320的O血清，用0.5%鹽水稀釋至1：40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內(nèi)等量混合，做單管凝集試驗。混勻后放于50℃水浴箱內(nèi)，經(jīng)16h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集，可證實為該O抗原。

6、腸毒素試驗：用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測LT和ST。

（1）產(chǎn)毒培養(yǎng)：將試驗菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種于0.6mLCAYE培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL，于37℃1h，離心4000r/min 15min，分離上清液，加入0.1%硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。

（2）LT檢測方法（雙抗體夾心法） ：具體過程參見LT和ST酶標診斷試劑盒，結(jié)果判定：以酶標儀在波長492nm下測定吸光度OD值，待測標本OD值大于陰性對照3倍以上為陽性，目測顏色為桔黃色或明顯高于陰性對照為陽性。

（3）ST檢測方法（抗原競爭法）：具體過程參見LT和ST酶標診斷試劑盒，結(jié)果判定：以酶標儀在波長492nm下測定吸光度（OD）值：目測無色或明顯淡于陰性對照為陽性。

綜合以上生化試驗、血清學(xué)試驗、腸毒素試驗作出報告。

四、大腸埃希菌的防治及生物安全防護

大腸埃希菌的生物危害評估報告

一、細菌的防治

首先應(yīng)正確地處理感染者的糞便,良好的衛(wèi)生以及用肥皂仔細洗手,有助于限制感染的傳播。

由于兒童和老人是易感人群，所以一旦出現(xiàn)感染，對其他人的預(yù)防措施將是必需的：應(yīng)將已知感染大腸埃希菌的患者集中看護；采用巴氏法消毒食品,可防止食物源性傳播。

治療則主要依靠支持療法.雖然大腸埃希菌對絕大多數(shù)常用抗生素敏感,但是抗生素并不能減輕癥狀,減少帶菌或防止HUS發(fā)生。在感染后的一周內(nèi),對發(fā)生HUS高危患者（如不滿5歲兒童,年老者）,應(yīng)該觀察其早期癥狀.發(fā)生并發(fā)癥的患者需要精心照料,包括透析和其他特殊的治療,這些可以在三級醫(yī)療護理中心進行。

二、細菌的生物安全防護

根據(jù)《病原微生物生物實驗室生物安全管理條例》中的有關(guān)規(guī)定，人間傳播的微生物名錄（待頒布）霍亂弧菌屬于三類，BSL-2。相關(guān)的防護事宜包括：

（1）操作要求

1、實驗時，未經(jīng)實驗室主任同意，限制或禁止進入實驗室。

2、不許在工作區(qū)域飲食、吸煙、清洗隱型眼鏡和化妝。食物應(yīng)存放在工作區(qū)域以外櫥柜或冰箱中。

3、所有的操作過程應(yīng)盡量細心，避免產(chǎn)生和濺出氣溶膠。

4、打碎的器皿不能直接用手處理，必須用其它工具處理，如刷子和簸箕、夾子或鑷子。盛污染的針頭、銳器、碎玻璃的容器在倒掉前，應(yīng)按照相關(guān)的規(guī)定進行消毒。

5、所有的培養(yǎng)物、儲存物及其它規(guī)定的廢物在釋放前，均應(yīng)使用可行的消毒方法進行消毒，如高壓滅菌。轉(zhuǎn)移到就近實驗室消毒的物料應(yīng)置于耐用、防漏容器內(nèi)，密封運出實驗室。離開該系統(tǒng)進行消毒的物料，在轉(zhuǎn)移前應(yīng)包裝，其包裝應(yīng)符合有關(guān)的法規(guī)。

6、濺出或偶然事件中，明顯暴露于傳染源時，要立即向?qū)嶒炇抑魅螆蟾妗＿M行適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)評估、觀察、治療，保留書面記錄。

7、按日常程序、在有關(guān)傳染源的工作結(jié)束后、尤其是傳染源濺出或灑出后、或受到其他傳染源污染后，實驗室設(shè)備和工作臺面應(yīng)當(dāng)使用有效的消毒劑消毒。污染的設(shè)備在送去修理、維護前，要按照相關(guān)的規(guī)定消毒；在離開設(shè)施轉(zhuǎn)移前，要按照相關(guān)的規(guī)定打包運輸。

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（2）安全設(shè)備

1、正確使用和保養(yǎng)生物安全柜、是*、或其他合適的人員防護設(shè)施、或物理遏制裝置。

2、確定可能形成傳染性氣溶膠或濺出物的實驗過程，包括離心、研磨、勻漿、劇烈震蕩或混勻、超聲波破裂、開啟裝有傳染源的容器、采集感染標本等。

3、涉及高濃度或大體積的傳染源時，若選用密封轉(zhuǎn)頭或帶安全罩的離心機，若轉(zhuǎn)頭或安全罩僅在生物安全柜中打開，則可在開放實驗室內(nèi)離心。

4、當(dāng)必須在生物安全柜外處理標本時，需采取面部保護措施（跟鏡、口罩、面罩、或其他防濺裝置），以免傳染源或其他有害物濺或灑到面上。

5、在實驗室內(nèi)，必須使用的防護性外衣、大褂、罩衫或制服。人員到非實驗室區(qū)域時，防護服必須留在實驗室內(nèi)。防護服可以在實驗室內(nèi)處理，也可以在洗衣房中洗滌，但不能帶回家中。

6、可能接觸潛在傳染源、被污染的表面或設(shè)備時，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重復(fù)使用，不能用于接觸“潔凈”的表面（鍵盤、等），也不應(yīng)當(dāng)戴著到實驗室外。要備有帶滑石粉的乳膠手套。脫掉手套后，要洗手。