zui全面的MTT相關(guān)技巧大匯總
　　
　　（一）實驗前應(yīng)明確的問題
　　
　　1.選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
　　
　　2.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
　　
　　3.時間點的設(shè)定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應(yīng)該就是的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯）。
　　
　　4.培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。
　　
　　5.MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
　　
　　6.理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實際情況調(diào)整。
　　
　　7.實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。
　　
　　8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
　　
　　（二）實驗步驟
　　
　　貼壁細胞：
　　
　　1.收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
　　
　　2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況
　　
　　3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
　　
　　4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
　　
　　5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
　　
　　6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
　　
　　7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）
　　
　　懸浮細胞：
　　
　　1）收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋l?g/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100?（儲存液1001640）。
　　
　　2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
　　
　　3）每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
　　
　　4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
　　
　　5）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復孔。
　　
　　（三）MTT的配制
　　
　　MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。
　　
　　MTT有致癌性，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.
　　
　　配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。