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1. 液氮法

　　目前，細胞凍存zui常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。

　　常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規格有35L3和50L3兩種。

　　細胞凍存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培養液，DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（121°C蒸氣高壓消毒），2mL安瓿（或細胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。

　　主要操作步驟為：

　　（1）選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。

　　（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

　　（3）將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數）。

　　（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內;置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態部分存放2小時，zui后沉入液氮中。

　　2. 分布降溫法

　　細胞系凍存程序：

　　1） 單層細胞的消化。將經24~48小時培養已長成單層的傳代細胞培養物棄去生長液，加適量ATV，1~2分鐘后倒棄ATV，再加入少量ATV液，經0.5～1分鐘倒去ATV，室溫或37oC溫箱作用2~3分鐘，視細胞解離情況，拍打細胞培養瓶。使單層細胞*解離。SP2/0瘤細胞，待生長好后用吸管吹打，再經1 000轉/ 分離心lO分鐘。

　　2） 離心洗滌：向培養瓶內加5~1 0m1預冷的MEM使細胞懸浮，再將其吸出置滅菌離心管中，以1 000rpm 離心8～10分鐘后棄去上清液。

　　3） 細胞懸液的制備：向離心管內逐滴緩慢加入預冷的凍存保護液，使細胞濃度為150~400萬/ml，然后迅速分裝于安瓿瓶中，每瓶加量為lml。

　　4） 致冷凍結：將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內，直立置不同條件下致冷凍結果保存：

　　a、4oC兩小時后移至一2OoC作用2小時，再移入一4OoC4小時后在一7OoC下24小時投入液氮。

　　b， 一20oC4小時后移致一4OoC。C經4小時移人一7OoC冰箱24小時，投入液氮。

　　c， 一4OoC4小時后移入一70oC24小時后投入液氮。

　　d、一20oC4小時后移入一70oC經24小時后投入液氮中。

　　e、一70oC24小時后投入液氮中。

　　5） 液氮中保存：將凍結后的安瓿裝入預冷的小布袋中，投入液氮。為防止安瓿漂浮，可預先在小布袋中加入幾塊小卵石。

　　3. 玻璃化法

　　玻璃化保存（Vitrification）是一種超速冷凍方法。它是以極快的速度冷凍細胞，使細胞內外的游離水迅速形成玻璃樣物質，而不形成冰晶。這種保存方法既避免了由于慢速降溫時導致的鹽濃度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理損傷，可獲得較高存活率。

　　玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他認為生命是生物活體系統的原子或其他結構元的一種特殊排列.并且輕微的排列位置擾動就會破壞平衡從而導致死亡，而結冰時的驅動力會破壞這種特殊的排列，這就是冰凍死亡的原因。玻璃

　　化比凍結固化方法引起的結構變化要小，因而是一種較理想的低溫保存途徑。

　　1981年，Fahy首先明確提出，用高濃度的低溫保護劑溶液，可在較慢地冷卻速率以及高壓條件下實現*的玻璃化，以后又發展了一些所謂“玻璃化溶液”，使細胞、組織乃至器官等范圍廣泛的生物系統玻璃化低溫保存成為可能。

　　1985年，Rail和Fahy[ 目用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功，是這種技術走向實用化的突破。