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補益中藥對運動性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子及 ECM 表達的影響
鄭孟君1，曹建民2，郭 嫻2，周海濤3
(1． 江南大學 體育學院，江蘇 無錫 214000;2． 北京體育大學 運動人體科學學院，北京 100084;
3． 北京聯合大學 生物化學工程學院，北京 100023)

摘 要: 觀察補益中藥對運動性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子及 ECM 表達的影響。方法:75 只 7 周齡雄性Wistar 大鼠隨機分為 4 組:安靜對照組(C 組，12 只)、一般訓練組(M 組，12 只)、過度訓練組(OM 組，24 只)和補益中藥 + 過度訓練組(TM 組，24 只)，M、OM、TM 組進行 8 周 56 天的游泳訓練。采用專業灌胃器每天灌胃 1 次，TM 組灌胃采用黃芪、紅景天、丹參、苦參等組成的復合中藥制劑，劑量為 1 g·kg － 1，體積為 5 mL·kg － 1，其他各組灌胃等量生理鹽水。末次訓練后 24 h，采用 PAS 染色觀察腎小球 ECM 沉積情況，免疫組織化學法檢測腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白表達，RT-PCR 法檢測腎組織 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA、TGF-β1 mRNA
表達。結果:1)8 周實驗后，腎小球 ECM 沉積，C、M 組間無顯著差異(P ＞ 0. 05);OM 組較 C、M 組顯著增加(P ＜0. 01);TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05)。2)血尿素氮和血清肌酐水平，OM 組和 TM 組顯著高于 C 組(P ＜ 0. 01)，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05);腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-18 蛋白表達，OM 組和 TM 組顯著高于 C 組(P ＜0. 01)，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05);腎組織 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA 和 IL-18 mRNA 表達，OM、TM 組顯著高于 C 組(P ＜ 0. 01)，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05);腎組織 TGF-β1mRNA 表達，TM 組(P ＜ 0. 05)和OM 組(P ＜ 0. 01)顯著高于 C 組，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05)。結論:8 周過度訓練致大鼠發生運動性腎缺血再灌注，同時 ECM 沉積加強。補充補益中藥可通過抑制腎臟組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 的表達進而減輕了過度訓練誘導腎臟缺血再灌注發生時腎臟組織 TGF-β1 的表達，抑制 ECM 的合成和(或)促進 ECM 的降解及組織病理學變，延緩或避免過度訓練導致的運動性缺血再灌注對腎臟的損害。
關鍵詞: 補益中藥;運動性腎缺血再灌注損傷;炎癥因子;細胞外基質

腎臟對缺血及缺血再灌注損傷異常敏感，運動及其恢復期腎血流量的兩個時相的改變導致了運動
性腎缺血再灌注損傷(exercise-related renal ischemiareperfusion injury，ERRIRI) 的整個過程［1］。近年的研究表明:在急性腎缺血再灌注損傷中 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18 這組功能密切相關的炎癥細胞因子發揮著重要作用［2］。腎缺血再灌注損傷所導致的炎癥因子的表達可以引起腎臟固有細胞的增殖，刺激其表達粘附分子并生成過多的細胞外基質( extracellularmatrix，ECM)，進而影響腎臟細胞外基質代謝平衡，并直接影響到組織細胞結構和功能的變化［3］。中醫理論認為，腎藏精，精生髓，髓養骨而通于腦。腎中精氣所化生之元氣，具有推動人體生長發育，溫煦和激發人體各臟腑、經絡等組織器官活動的作用，為人體諸氣的根本［4］。長期過度訓練導致的運動性疲勞，先耗傷脾陽，久則及腎;脾腎同為精血生化之源，陽氣之根本，脾腎耗傷，陽氣受損，精血生化不足，則導致運動的原動力不足，產生諸多疲勞綜合癥［5］。具有多靶點、多途徑作用且幾乎不含違禁成分優勢的中藥，對過度訓練導致的 ERRIRI 的保護作用，已為運動醫學界所重視。但目前有關中藥對運動訓練與炎癥細胞因子及腎組織細胞外基質代謝間的相互作用關系的調節功能的研究尚未見報道。故本實驗選用黃芪、紅景天、丹參、苦參等中藥材，結合前期研究適當增減組方制成復合中藥制劑，觀察其對炎性細胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白及基因表達的影響及對腎臟 ECM 代謝、ECM 沉積的調節作用，進而研究補益中藥對過度訓練導致的運動性腎缺血再灌注損傷的保護作用和機制。
1 材料與方法
1. 1 動物和分組［6］
清潔級 75 只雄性 Wistar 大鼠，49 d 齡，體重(196. 95 ± 11. 36)g，由北京大學醫學部實驗動物科
學部提供，動物生產合格證編號 SCXK(京)2006 －0008。整個實驗中，實驗室溫度保持在(22 ± 2)℃，
相對濕度 55% ～ 75% ，光照時間隨自然變化。大鼠以基礎飼料(北京大學醫學部實驗動物科學部提
供) 和蒸餾水常規飼養，自由飲食。實驗時間為63d，正式訓練 56d。動物實驗于北京體育大學運動
營養實驗室完成。大鼠適應性飼養 4 d 后，以 20 min·d － 1的運動量對其進行為期 3d 的篩選，淘汰個別不適應的游泳者，剔除不符合實驗要求的大鼠，剩余大鼠以數字隨機分組法分為 4 組:對照組(C 組，12 只)、一般訓練組(M 組，12 只)、過度訓練組(OM 組，24 只)和中藥+ 過度訓練組(TM 組，24 只)。采用專業灌胃器每天灌胃一次，TM 組劑量為 1 g·kg － 1，灌胃體積為 5mL·kg － 1，其他各組灌胃等量生理鹽水。
1. 2 實驗用藥
復合補益中藥制劑主要成分為黃芪、紅景天、丹參、苦參等，購自北京同仁堂，批號:120324154，并經
天津中瑞藥業有限公司高級工程師高占友鑒定。按比例稱取藥品 50 g 加水 500 mL，浸泡 30 min 后煎
30 min，過濾所得水煎液，再將過濾后的水煎液加水500 mL 煎 30 min，過濾所得水煎液。將兩次過濾的水煎液混合，濃縮至濃度 1 g(生藥)·mL － 1，4 ℃ 存放備用［6］。
1. 3 訓練及測試方案
C 組常規飼養，不運動，無任何干預。M 組進行正式中等強度游泳訓練 8 周(無負重)，每周 6 d，每
天 1 次，第 1 次下水游 20 min，此后逐漸增加，至第 1周末每天游 60 min，第 2 周末加至每天游 90 min，第3 周末加至每天游 120 min，此后 5 周均保持此運動量。TM 組和 OM 組前3 周訓練時間安排同 M 組，第4 周起開始安排高強度訓練。第 1 ～ 3 周負 0. 5% 體重，第 4 周負 1% 體重，第 5 周負 2% 體重，每天訓練1 次。第 6 周負 2% 體重，每天上、下午各訓練 1 次，第 7 ～ 8 周，每天上午、下午、夜間各訓練 1 次，均負5% 體重［6］。大鼠進行負重游泳，每次訓練至力竭。力竭標準以大鼠下沉后 10 s 不露出水面為準。C、M 組大鼠均正常生長，無意外死亡。TM 組和 OM 組大鼠因尾部負重，疲勞、力竭不能恢復及訓練意外死亡等原因，死亡率較高。至第 8 周末時，TM 組 24 只僅剩 14 只，OM 組 24 只僅剩 11 只。
1. 4 指標測定
末次游泳訓練 24 h 后，各組大鼠yi醚適度麻醉，頸總動脈取血，加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37 ℃ 水浴 30 min 后，4 ℃、3 000 r /min 離心 10 min，分離制備血清，置 － 20 ℃ 冰箱中保存待查。迅速取腎，剔除筋膜，置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，觀察腎臟大小、色澤、質地，切取腎組織，分別用消毒鋁箔包好，迅速投入液氮暫存，隨后保存于 － 70 ℃ 冰箱凍存待測［6］。取部分腎組織，10% 甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm 厚切片，PAS 染色并進行組織病理學分析。采用 Jaffe ku味酸法測定血清肌酐，采用二乙酰 － 肟法測定血清尿素氮，采用免疫組織化學法測定檢測腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白表達，采用 RTPCR 法測定腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、TGF-β1 基因表達。以上試劑盒均由上海恒遠生物科技有限公司提供。
1. 5 PAS 染色切片圖像分析
PAS 染色切片，在 400 × 物鏡下采用北航圖像采集模塊軟件采集視野中同時切到尿極和血管極的腎小球(每張切片約有 8 ～ 10 個)，隨后運用北航醫學病理圖像分析軟件描繪腎小球毛細血管拌輪廓，區分基質和細胞成分，并測量單個腎小球平均面積及其基質面積［18］。
1. 6 統計學分析
采用 SPSS 12. 0 軟件對所有數據進行分析、處理，數據用平均數 ± 標準差(X珔± S)表示，組間差異
采用方差分析，等級計數資料采用秩和檢驗分析，相關關系采用 Pearson 相關分析。顯著性水平為 P ＜0. 05，非常顯著性水平為 P ＜ 0. 01。

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