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法定量蛋白質的實驗原理

閱讀:339發布時間:2016-4-20

   ELISA試劑盒法又稱考馬斯亮藍法,是于 1976 年建立起來的一種蛋白質濃度的測定方法。法定量蛋白質的原理是馬斯亮藍(CBB)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍在游離狀態下呈紅色,zui大光吸收在488nm;以下是法定量蛋白質的原理及含量測定流程
 法定量蛋白質的原理
考馬斯亮藍(CBB)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍在游離狀態下呈紅色,zui大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合后變為青色,蛋白質—色素結合物在595nm波長下有zui大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍結合在2min左右的時間內達到平衡,完成反應十分迅速;其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質含量,測定蛋白質濃度范圍為0~1 000μg/ml,是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。
法定量蛋白質的含量流程:
該方法用于大多數蛋白質的定量是比較的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖酸酶或*。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1.濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,然后,用蒸餾水補充至1000ml,此染液放4℃至少6個月保持穩定。
2.標準曲線蛋白質樣本的準備:盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。
3.將待測樣本溶于緩沖溶液中,該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(用PBS)。
4.按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現沉淀,過濾除去。
5.每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質結合后,將由紅色變為藍色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min.
6.根據標準曲線計算待測樣本的濃度。
注意:
考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合,反應快速,并且穩定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。
法定量蛋白質的原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合后,其對可見光的zui大吸收峰從 465nm 變為 595nm。一般情況,當溶液中的蛋白質濃度增加時,顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加,因此可以用法來測定溶液

Angiotensin II    血管緊張素Ⅱ抗體
AT2R    血管緊張素Ⅱ受體1抗體
Angiopoietin-1    血管生成素-1抗體
Annexin V    膜粘連蛋白5抗體
Annexin V    重組膜粘連蛋白5抗體
alpha Adaptin    銜接蛋白α-Adaptin抗體
APAF1(CT)    凋亡蛋白活性因子-1抗體(C端)
APAF1(NT)    凋亡蛋白活性因子-1抗體(N端)
ABCG2    三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2抗體
APOE    載脂蛋白E抗體
Amyloid Precursor Protein    淀粉樣肽前體蛋白抗體
Aquaporin 2    水通道蛋白-2抗體
AGT    血管緊張素原抗體
Androgen receptor    雄激素受體抗體

ELISA試劑盒

 


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