臨床使用ELISA試劑盒的基本原理
此處的反應體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測定，但比反應管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應發生于液體-固相界面，可能處于一級結合鍵的引力距離內，小于100Å。ELISA試劑盒液相中待測抗原或抗體要進入到這個結合界面，需要經過擴散或質量轉移。微顆粒的反應表面區域較微孔要大得多，因而處于抗原抗體結合界面的體積占總反應體積的比例亦高得多。
因此，結合反應的效率更高。這也是全自動化免疫測定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一。可參與結合反應的抗體或抗原的濃度取決于可參與結合的反應體積，無法計算這種反應體積，從而難以使用通常的質量作用定律圖形來計算Keq。因此，固相上抗原與抗體反應的Keq值與液相抗原與抗體反應的Keq值沒有可比性。使用固相包被的復雜抗原進行微孔內特異抗體的免疫測定，ELISA試劑盒與液相測定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體-配體相互作用的穩定性，似乎與微孔內特異抗體的免疫測定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因為：（1）在所吸附于固相的復雜抗原中，能與液體中特異抗體結合的抗原濃度極低。
這可能是由于所吸附的抗原因為變性或空間位阻而致抗原表位喪失的結果。（2）抗原表位由于固相吸附發生改變，使得特異抗體與其結合的親和力較低。當抗原以1~5g/ml濃度被動吸附于固相時，大多數蛋白抗原的60-80%至少會以一個單層而穩定的吸附于固相，ELISA試劑盒這樣在固相上的總的抗原就不會缺乏。如果500-800 ng抗原穩定的吸附于微孔板孔，對含500g/ml抗體的血清的1：10,000稀釋可提供大于10倍過量的抗原，考慮到抗原和抗體間相互作用的合理的Keq，只是從吸附抗原的量的有限性，不能解釋固相上抗原與抗體結合的低親和力，而更可能是由于空間位阻或吸附引起的變性所致的抗原表位的喪失所致。
