RT-PCR實驗提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度方法

2024年06月03日 10:33上海撫生實業(yè)有限公司點擊量：497

較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴(kuò)增可以使用 ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物(GSP)進(jìn)行cDNA合成時(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。

Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會降低忠實性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴(kuò)增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉(zhuǎn)錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，那么沒有逆轉(zhuǎn)錄的對照反應(yīng)就不能用來將cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物同污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開來。

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