一．原理
基因組步行技術(shù)是一種新發(fā)展的利用已知序列(cDNA或基因組DNA)從基因組中獲得基因的上游(如啟動(dòng)子) 或下游序列的方法。 其原理如下：首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性內(nèi)切酶消化基因組 DNA，然后將預(yù)先設(shè)計(jì)好的 DNA 接頭連接在 DNA 的兩端, 這樣的一組兩端帶有接頭的 DNA 片段就稱為所謂的無載體的 DNA 文庫；根據(jù)接頭和目的基因的序列設(shè)計(jì)兩組引物，以上述的DNA為模板，先以外側(cè)的一組引物進(jìn)行*輪 TD-PCR ( touchdownPCR ) 擴(kuò)增，然后以內(nèi)側(cè)的一組引物進(jìn)行巢式 TD-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為所需的DNA片段。在接頭中，由于2條鏈中較短的一鏈的3’末端被 2NH2 封閉，使得引物 AP1 在*次 PCR 之
前沒有結(jié)合位點(diǎn)，在 PCR 的*循環(huán)過程中只能從 GSP1 延伸，沒有 AP1 的延伸產(chǎn)物。而GSP1 的延伸產(chǎn)物產(chǎn)生了 AP1 的結(jié)合位點(diǎn)，在第二循環(huán)就開始從兩端進(jìn)行延伸反應(yīng)。這樣，就減少了非特異性擴(kuò)增，從而提高了 PCR 的特異性.基因組步行由 2 輪 TD-PCR 反應(yīng)組成。在 TD-PCR 的初始循環(huán)中，所采用的退火和延伸溫度比引物的 Tm 值略高，在這種情況下引物退火的效率會(huì)下降，但是特異性將增加；另外，在極少數(shù)情況下接頭的 2NH2 也會(huì)延伸，補(bǔ)平接頭，這樣也產(chǎn)生了 AP1 的結(jié)合位點(diǎn)，從而增加了非特異性擴(kuò)增，但在高溫下，接頭的自我退火比引物與接頭退火的效率高，就提高了針對(duì)于 AP1 的 PCR 抑制效應(yīng)，減少非特
異性擴(kuò)增。在隨后的循環(huán)中，退火和延伸溫度比 Tm 值略低，有利于特異性產(chǎn)物的指數(shù)增長(zhǎng)。基因組步行技術(shù)主要應(yīng)用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的啟動(dòng)子或其他上游調(diào)控序列的快速克隆，該技術(shù)也可用于確定內(nèi)元/外元的連接以及從任何序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence2tagged site, STS) 或 EST 兩端進(jìn)行擴(kuò)增獲得相應(yīng)的序列。盡管一次步行獲得的片段長(zhǎng)度短于 6 kb，但可通過多次反應(yīng)獲得更長(zhǎng)的片段。該方法對(duì)于填補(bǔ)基因組
中的一些間隙，特別是當(dāng)這些缺失的克隆通過常規(guī)的篩選文庫很難得到時(shí)非常有

一、高質(zhì)量基因組DNA 的提取
1 材料
實(shí)驗(yàn)魚， 尾靜脈取血100 μl(含抗凝劑)
2 試劑
Qiagen Genomic 20/G；Tip Holders；Buffer C1；Buffer QBT；Buffer QF 抗凝劑 : 0.48%檸檬酸，1.32%檸檬酸鈉，1.47%葡萄糖
3. 方法
1）樣品的處理和裂解
(1) 將100μl魚血用PBS稀釋至1ml
(2) 加入1倍體積冰冷的Buffer C1，3倍體積（3ml）的ddH2O 。
(3) 翻轉(zhuǎn)數(shù)次至懸冷液成半透明
(4) 冰浴10min。
(5) 4℃，1300g離心15min，棄上清液。
(6) 加入250μl冰冷的Buffer C1，750μl冰冷的ddH2O。
(7) 輕彈，溶解沉淀。
(8) 4℃，1300g離心15min，棄上清液（如沉淀不是白色，重復(fù)洗滌步驟）。
(9) 加入1ml Buffer G2，zui大速漩渦10-30s，充分重懸核酸沉淀物（時(shí)間要控制得很嚴(yán)格）。
(10) 加入25ul QIAGEN Protease，50℃保育30-60min（如有必要可延長(zhǎng)保育時(shí)間）。
2）DNA的提取