PCR技術具有高度的特異性、選擇性、靈敏性，而且快速、簡便、易于自動化，因此在臨床醫學工作中受到廣泛的重視及合理的應用。目前在我國許多基層醫療單位均已相繼開展PCR研究用應用工作。PCR技術很簡單，原理也很清楚，因此有條件的單位都能較順利地上馬，但畢竟PCR技術是一種新生事物，受到許多條件因素的影響，所以要做得好也不容易。在pcr技術應用過程中會遇到這樣或那樣的問題，更甚至會得到與事實完成相反的結果。為了使我們能夠順利地開展PCR工作，更好地發揮PCR技術的工具作用，我們根據多年來PCR工作總結的經驗，對PCR擴增過程中經常出現的一些問題進行簡要的總結，提供給廣大科研工作者作為參考，拋磚引玉，不足之處歡迎指正。
　　
　　一、假陽性擴增
　　
　　在實驗過程中有時會碰到所檢驗的樣本全部陽性，而且擴增產物電泳條帶亮度均一，這是擴增系統受到污染時zui典型的一種表現，需仔細檢查，排除污染源，一般應從以下步驟著手：
　　
　　⒈試劑污染：
　　
　　廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運輸、貯存過程中受到污染。檢測方法，可按試劑盒說明書將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴增（不加陰性對照，可加適量蒸餾水），便可簡單而有效地判斷試劑是否已受到污染。
　　
　　⒉實驗室污染：
　　
　　這是zui常見的污染源，由于PCR技術可以在幾個小時內將模板中某些特異性序列擴增到數百萬倍以上，擴弗產物可能在電泳等過程中污染移液器、操作臺或隨著蒸發所形成氣溶膠而污染整個實驗室。擴增產物又是zui有效的模板，一旦出現產物污染其污染程度都較嚴重。判斷方法：可以將實驗中zui關鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉移到一個新的環境中或轉移到超凈工作臺中完成。當然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應*更換。解決方法：實驗室污染是pcr擴增過程中zui易出現的現象，而且一旦出現污染，消除污染源又極其困難，往往需對整個實驗室及實驗器材*清洗處理，所以應該以預防為主，實驗過程中嚴格遵守實驗基本要求，樣品處理與擴增產物及電泳應盡量分開，能在兩個房間進行。擴增前處理所用的移液器及擴增后點樣用的移液器應嚴格地分開，不可互換。PCR室應保持良好的通風、清潔、能。
　　
　　⒊采樣污染：
　　
　　在實驗過程中，有時會出現一批結果陽性率很高，一批結果陽性率又下降很多，如此反復，這種現象大都是由于采樣時污染所致，一般來講正規試劑生產廠家，其試劑出廠時都要經過嚴格的質量檢測、批間，特別是批內差異都極小，不致出現如此明顯的反復，這種現象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。PCR擴增非常敏感，而一般實驗室對重復使用的試管所進行的洗滌方法往注不能去除痕量DNA，這些痕量DNA便成為PCR模板，出現陽性擴增結果，由于采樣試管受污染程度不一，所以出現忽高忽低的現象解決方法建議使用一次試管及吸咀取樣。
　　
　　二、假陰性擴增：
　　
　　如果連續幾次擴增結果都是陰性，或已知陽性樣本出現陰性擴增結果，一般認為這是假陰性，出現這現象有以下幾種原因：
　　
　　⒈儀器故障：
　　
　　出現全陰結果，首先考慮到儀器運轉是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎，儀器運轉是否正常是PCR擴增zui關鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常，首先要測定加熱體的溫度是否準確，波動范圍是否答合要求，各孔之間差異是否符合要求，PCR擴增往往對儀器加熱溫度及各管間的差異要求有很高的精度，如果誤差太大，勢必出現假陰性。必須注意的是不能過信，我們經常發現一些機器溫度差異高達二度以上。
　　
　　⒉試劑失效或無效：
　　
　　了解機器是否正常，便可對試劑進行檢測。首先要了解試劑是否超過有效期，試存放方法是否達到要求，如果試劑盒在有效期內，貯存方法是正確，那么就應該仔細、慎重地判斷試劑是否是無效試劑或稱不合格試劑。可以用已知陽性樣本，或試劑盒提供的陽性對照，嚴格按說明書操作擴增一次，然后把擴增產物用雙蒸水稀釋1000倍，作為模板進行第二次擴增，判斷結果，如果是陰性說明試劑無效或不合格，如果結果陽性那么可用以下方法判定試劑的靈敏度。