谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說明書由上海遠慕生物詳細介紹，本司現貨供應ELISA試劑盒，標準品對照品，動物血清，培養基，抗體，細胞株，瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠，多肽，酶類，碳水化合物，生物分子，微生物，生化試劑，化學試劑，實驗耗材，染色液，其他試劑等，歡迎訂購！

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B參數說明】

中文名：谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B

英文名：Glutathione Sepharose 4B 

供應商：上海遠慕

規格：10ml、50ml

操作溫度：4-40℃

結構成分：4%交聯瓊脂糖

配基偶聯量：40μmol phenyl/ml 凝膠

保存條件：4℃

性狀：白色微球，凝膠狀，保存在20%酒精溶液中

應用：疏水層析介質，適合含芳香族配體蛋白純化，特別適合單抗的純化等

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說明

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用方法】　

谷胱甘肽樹脂的處理：

1、輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿。

2、取部分勻漿放入15mL聚丙烯管(每100mL細菌培養物大約需要2mL勻漿)。

3、4℃500g離心5分鐘，小心去掉上清。

4、在樹脂中加入10倍柱床體積預冷的PBS，顛倒數次混勻，4℃500g離心5分鐘，小心去掉上清。

5、每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數次，混合均勻，懸液冰上放置待用。

制備細胞抽提物：

1、每100毫升培養物的細胞沉淀重懸于4mLPBS緩沖液中。

2、加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

3、用針筒將10mL濃度為0.2%的TritonX-*行注入黏稠的細胞裂解物中，劇烈振動數次混勻；加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL,4℃振動溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘，去除不溶性細胞碎片，上清轉移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L。

純化融合蛋白：

1、細胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和，每100毫升細菌培養物加2mL樹脂，于室溫輕搖30min。

2、混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3、沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白。

4、4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5、重復步驟11和12兩次。

6、結合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割，釋放靶蛋白。用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：

7、沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min，洗脫樹脂小心去掉上清。

8、每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數次，混合均勻，懸液冰上放置待用。制備細胞抽提物：

9、每100毫升培養物的細胞沉淀重懸于4mLPBS緩沖液中。7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

10、用針筒將10mL濃度為0.2%的TritonX-*行注入黏稠的細胞裂解物中，劇烈振動數次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL,4℃振動溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘，去除不溶性細胞碎片，上清轉移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L。

純化融合蛋白：

1、細胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和，每100毫升細菌培養物加2mL樹脂，于室溫輕搖30min。

2、混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3、沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白。

4、4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5、重復步驟11和12兩次。

6、結合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割，釋放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：　

1、沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min，洗脫樹脂上結合的蛋白。

2、4℃以500g離心5分鐘，上清(含洗脫的融合蛋白)移至新管中。

3、重復步驟a和b兩次，合并3次上清。蛋白酶解從結合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

4、在結合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa因子(根據融合蛋白中的位點選擇)，每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數次混勻，室溫下振蕩2—16小時。用小規模實驗確定時間。19.4℃以500g離心5分鐘，上清小心移至新管中。(GST仍結合在樹脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分離)20.10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質組成。

試劑配制：

谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/LTris-Cl(pH8.0)

相關試劑：

PMSF(100mM)

溶菌酶(100mg/mL)

IPTG溶液(50mg/mL)

1MTris-HCl(PH=8.0)

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒

His標簽純化樹脂(Ni-NTAResin)

預染低分子量蛋白MARKER

BCA蛋白濃度測定試劑盒

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B說明】

pGEX載體表達的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉移酶融合，因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作為底物，通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白的純化效率很高。可以用含游離谷胱甘肽的緩沖液洗脫結合GST融合蛋白；樹脂用3mol/LNaCl的緩沖液再生；谷胱甘肽瓊脂糖對GST融合蛋白的結合能力很強(每毫升柱床體積的樹脂能結合8毫克融合蛋白)。

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