1. 前目

葉綠體是綠色植物組織中一種重要的器官，其主要功能是執(zhí)行光合作用。除此之外 ，許多重要的化合物也在葉綠體內(nèi)合成，如植物激素、脂肪酸和油脂、氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶核酸、四吡咯類化合物及類異戊二烯等。葉綠體也是植物細胞內(nèi)同化氮和硫的場所 。其內(nèi)包含有大量的蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶、定位元件、輔因子伴侶、組裝元件、肽酶及蛋白酶等，對于蛋白質(zhì)生物合成和胞內(nèi)平衡具有重要作用。葉綠體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類多樣，包括與質(zhì)體 DNA 及 mRNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)對葉綠體內(nèi)基因的表達具有重要作用 。據(jù)估計，與不同種類質(zhì)體結(jié)合的蛋白質(zhì)共計 2000~4000 種。其中約 550 種是含有 α 螺旋的跨膜蛋白或者膜結(jié)合蛋白 ，而葉綠體基質(zhì)則含有多于 1000 種的蛋白質(zhì)。到目前為止，已經(jīng)有許多研究對擬南芥類囊體和葉綠體膜蛋白質(zhì)組進行了詳細的探討 。

本章介紹的葉綠體分離方法主要是基于 David  Christopher 博士，以擬南芥為材料所發(fā)展出來的一種方法，同時還參考了一些已經(jīng)發(fā)表的從豌豆和菠菜中分離葉綠體的方法 。在上述基礎(chǔ)上，我們進一步優(yōu)化了分離方法，并將其用于本實驗室大規(guī)模的葉綠體分離和蛋白質(zhì)組分析工作中 。這種方法沒有進行過葉綠體蛋白質(zhì)輸入活性的測試，但是本方法具有產(chǎn)率高，污染低的優(yōu)點，尤其適合于葉綠體的蛋白質(zhì)組分析。關(guān)于用于體外蛋白質(zhì)輸入活性試驗的葉綠體分離方法，可以參考其他的一些報道  。

2. 材料
( 1 ) 介質(zhì) A  ( 勻漿緩沖液，見注釋 1)：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、330 mmol/L 山梨醇、2 mmol/L EDTA -Na2  ( pH 8.0 )、5 mmol/L 抗壞血酸維生素 C 、5 mmol/L 半胱氨酸，0.05% 牛血清白蛋白 （BSA ) (可以忽略以減少對后所得樣品的污染，見注釋 1)。
( 2 ) 介質(zhì) B ( 清洗溶液）：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、330 mmol/L 山梨醇、2 mmol/L EDTA-Na2 ( pH  8. 0)。
( 3 ) 介質(zhì) C ( 裂解液）：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、5 mmol/L MgCl2、蛋白酶混合抑制劑
( 4 ) 100% PF-Percoll：0.8 g PEG 8000、0.27 g Ficoll  400000，加 Percoll 至終體積為 27.5 ml。
( 5 ) Percoll 梯度：PF Percoll  ( 40% 或 85% ) 、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、330 mmol/L sorbitol。
( 6 ) 濃縮離心設(shè)備（包含 3kDa 過濾器，如 Millipore 公司的 Amicon 3kDa)。

4. 注釋
( 1 ) 制備 1 L 介質(zhì) A：60.1 g 山梨醇、50 ml  1 mol/L HEPES-KOH 貯存液（ pH 8.0) 、4 ml  0.5 mol/L EDTA  (滅菌貯存液），加雙蒸水至終體積 1 L。使用前新鮮加入 0.88 g 抗壞血酸維生素 C 、0.6 g 半胱氨酸和 0.5 g BSA  ( 可以忽略以降低對終葉綠體樣品的污染）。
( 2 ) —般 40~50 株*生長的擬南芥植物材料須用 1 L 研磨緩沖液。的比例和研磨時間根據(jù)不同的實驗室和操作者根據(jù)各自的經(jīng)驗確定。
( 3 ) 尼龍布在使用前用研磨緩沖液浸濕。
( 4 ) Percoll 非連續(xù)密度梯度制備，直接在 85% Percoll 表面慢慢注入 40% Percoll，或者用移液管在 40% Percoll 下面注入 85% Percoll 即可。
( 5 ) 葉綠素濃度測定參照文獻 [ 20 ] 進行。將 2~5 μl 葉綠體或類囊體溶液加入 1 ml 80% 冰上預(yù)冷的丙酮中，振蕩后在暗處于冰上靜置 10 min。4°C 條件下 15000 g 離心 5 min。收集綠色上清液部分，測定其在 663.2 nm 及 646.8 nm 處的吸光值。葉綠素 a 濃度 + 葉綠素  b 濃度（ μg/ml)  = ( 1+v）/v X（7.15X A663.2 + 18.71 X A646.8 ) 。
( 6 ) 也可以直接在 300000 g 條件下離心 25 min，然后收集類囊體和包膜結(jié)構(gòu)。但是在這種離心力下得到的沉淀難以重新懸浮，同時，高離心力可能會導(dǎo)致囊腔和一些外膜蛋白流失到基質(zhì)蛋白部分。