經常提質粒嗎？熟練之后，提質粒乃至質粒構建都很簡單。但如果真問起一些質粒的細節，可能很多人回答不了。不信隨我看看。

質粒組成要素

一個合格的質粒含有以下組成部分：

復制起始位點 Ori 即控制復制起始的位點。原核生物 DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物 DNA 分子有多個復制起始位點。

抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如 Amp+ 、Kan+。

多克隆位點 MCS 克隆攜帶外源基因片段

P/E 啟動子/增強子

Terms 終止信號

加 poly（A）信號 可以起到穩定 mRNA 作用

如何閱讀質粒圖譜

步：首先看 Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）。

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

Ampr 水解β－內酰胺環，解除氨芐的毒性。

tetr 可以阻止四環素進入細胞。

camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418（長那霉素衍生物）失活

hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。

啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號

啟動子－促進 DNA 轉錄的 DNA 順序，這個 DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。

增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。

核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。結構基因的后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。

為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質粒是環狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

如何選擇載體

把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

P.S. 基因工程所用的 vector 實際上是 DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的 DNA。

選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

載體選擇主要考慮下述 3 點：

1. 構建 DNA 重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

2. 載體的類型：

克隆載體的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb 選質粒。

表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。

對原核表達載體應該注意 3 點：選擇合適的啟動子及相應的受體菌；用于表達真核蛋白質時注意克服 4 個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。

3. 載體 MCS 中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。

選用質粒（常用）做載體的 4 點要求：

選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5 kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）；

一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般 10 個以上的拷貝，而嚴謹型質粒 < 10 個。

必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；

必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。

無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當的限制酶將載體 DNA 進行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進行連接。