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哺乳動物細胞 siRNA 轉染方法

時間:2012-12-19閱讀:1519
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  1磷酸鈣共沉淀將氯化鈣,RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合,沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒.磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質.沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要.在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準,保證質量,因為甚至偏離*條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗.
  
  2電穿孔法電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子.將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異,據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔.電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要,因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞.一般,成功的電穿孔過程都伴隨高水平(50%或更高)的毒性.
  
  3DEAE-葡聚糖和polybrene帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面.通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入.兩種試劑都已成功用于轉染.DEAE-葡聚糖于瞬時轉染.
  
  4陽離子脂質體試劑在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時,其可以形成微小的(平均大小約100-400nm)單層脂質體.這些脂質體帶正電,可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面.因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同.使用陽離子脂質體試劑,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物.據稱,一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體.被俘獲的DNA就會被導入培養的細胞.現存對DNA轉導原理的證據來源于內吞體和溶酶體.

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