PCR

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）是指由一對引物介導的基因或克隆的特定DNA序列的酶促擴增的反應過程，即在一對人工合成的特異性引物介導下，以目的DNA為模板，使用耐熱DNA聚合酶，經變性、退火及延伸三個步驟的多次循環，擴增特定DNA片段的過程（其本質是DNA復制）。

添加到反應體系的物質有：

1.待擴增的DNA模板（template）

純度要高（可通過電泳鑒定）

2.與模板DNA的5`端和3`端序列互補配對的寡聚DNA（即上游引物P1和下游引物P2）（primer）

引物一般設計為20-30bp，合成，合成量一般為2 OD，純化方式可選用PAGE等方式。

3.反應底物dNTP

使用時注意單位量（10mM還是2.5mM）及推薦使用量。

4.耐熱DNA聚合酶（Taq酶）

酶易失效，需要及時分裝保存。

5.緩沖溶液（Buffer）

6. PCR水

通常情況下，打開試劑產品（引物，酶等）之前，要注意一下方面：

1． 保存溫度

2． 保質期

3． 做適當離心，并做試劑（高濃度）分裝，可防止污染浪費、反復凍融并易稀釋成其他濃度。分裝過程注意防止污染（如采用雙蒸水滅菌后分成小管單獨保存于冰箱作為PCR水；進行無Nase和RNase處理等等）。

反應體系以20uL-100uL為宜，若選取50uL,則可按照順序依次加入一下物質：

PCR水   41uL                  38uL

Buffer      5uL                   5uL

P1、P2     各1uL         或     各1uL

dNTP       1uL（10mM）         4uL （2.5mM） 

Taq酶      0.5uL                 0.5uL

zui后加入模板0.5 uL。

注意：1.設置對照組，陰性對照必須有，陽性對照可選。

2．可先配多管的體積，混勻再分裝，并可多做一管的反應量，減少誤差。

PCR參數的設定:

  99℃預熱5min

  94℃變性30s

55℃退火30s       25-35個循環

72℃延伸1min

72℃延伸7min

完成后可在PCR儀作15℃保存。

zui后做瓊脂糖凝膠電泳，電泳膠的濃度和體積根據實際需要確定。流程如下：

  瓊脂糖+TBE（0.5%）

微波爐中火加熱約2.5min，注意不要過度沸騰，導致濃度改變

冷凝至55℃左右（用手感覺溫度）

加1-2滴EB（致癌劑，所以整個配膠過程中注意保護自己，儀器，防止污染環境）

倒膠（注意梳子處不要出現氣泡，如有則趕至邊緣區）

待凝固后即可上樣【loading buffer和樣品（約10uL）混勻再上，并上Marker】,注意混勻時槍頭不要吸進空氣，防止產生氣泡，上樣時槍頭應垂直插入上樣孔。

電泳（一般160V約30min,注意膠的位置，不要正負極倒置，電源接通后觀察鐵絲是否有氣泡）

電泳完后在紫外燈下觀察電泳結果。

注意事項及結果分析：

1． PCR反應的加樣量多數是微量的，所以加樣時應把槍頭伸進液面下加樣，并注意確保試劑確實加進去了！

2． 加樣過程中注意防止污染樣品及試劑。

3． 若PCR反應電泳結果不理想，應及時排除尋找原因。可以按照退火溫度，dNTP，引物，酶，模板的順序來排除查找。